Clonagem e expressão de epítopo plasmodial na alça EoFo da proteína E da cepa vacinal 17D de febre amarela / Cloning and expression of plasmodial epitope in the EoFo of E protein of the cepa vaccine 17D of yellow fever

RESUMO

Neste trabalho é descrita uma nova abordagem para inserção e expressão de epítopos heterológicos na proteína E do envelope do vírus da febre amarela (FA) 17D. O sítio escolhido foi a alça EoFo do domínio I ou central da proteína E. Para permitir a expressão destes antígenos na superfície externa da partícula viral, a seleção desta região foi baseada no alinhamento das seqüências de aminoácidos da proteína E de diferentes Flavivírus e no modelo tri-dimensional criado para a proteína E do vírus FA. Três estratégias de clonagem envolvendo diferentes mutações, deleções ou duplicação de resíduos de aminoácidos da alça EoFo foram aplicadas para a inserção de um epítopo exógeno repetitivo - (NANP)3. Este determinante antigênico pertence ao domínio central da proteína CS de Plasmodium falciparum e induz resposta imune humoral. Foram então desenvolvidos três novos vírus FA vetores parentais e três vírus FA recombinantes expressando o epítopo malárico. Os diferentes vírus foram capazes de replicarem-se em células Vero, porém em uma taxa abaixo do controle vacinal vírus FA 17DD. Estas construções virais mostraram-se geneticamente estáveis durante 10 passagens seriadas em células Vero com m.o.i. conhecida (0,02), apesar de terem sido detectadas algumas mutações pontuais que levaram à troca de aminoácidos na proteína E. Além disso, os vírus FA recombinantes expressando (NANP)3 foram menos virulentos em relação à linhagem vacinal 17DD, quando inoculados por via intra cerebral em camundongos. Após a inoculação em camundongos, os vírus recombinantes foram capazes de induzir resposta imune dirigida ao vírus FA, assim como ao epítopo malárico. Todas as etapas de caracterização biológica das novas construções virais mostraram que as mudanças genéticas introduzidas no genoma do vírus FA não comprometeram a estrutura e função virais. Estes resultados realçam o potencial uso deste sítio para o desenvolvimento de novas vacinas atenuadas baseadas no vírus 17D.