Purificação e expressão de vesículas extracelulares humanas e a correlação com a toxoplasmose / Purification and expression of human extracellular vesicles and the correlation with toxoplasmosis

RESUMO

O objetivo deste estudo foi isolar e caracterizar as vesículas extracelulares (EVs) humanas e compará-las entre grupos de indivíduos com ou sem toxoplasmose, uma zoonose de distribuição mundial e de importância na saúde pública por seu papel na gestação e na co-infecção com o vírus da imunodeficiência humana (HIV). Oitenta e três amostras clínicas foram divididas em grupo I, 20 plasmas de indivíduos saudáveis e gestantes (soronegativos para toxoplasmose); grupo II, 21 plasmas de pacientes com toxoplasmose sintomática; grupo III, 26 amostras de líquido cefalorraquidiano (LCR) de pacientes com toxoplasmose cerebral e co-infecção por HIV (TC/aids); e grupo IV, 16 amostras de LCR de pacientes sem toxoplasmose, mas com aids e outras infecções oportunistas (OI/aids). Após a recuperação das EVs por ultracentrifugação as amostras seguiram para análise de tamanho e concentração por Análise de Rastreamento de Nanopartícupas (NTA); morfologia, por Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM); perfil proteico, por SDS-PAGE/Imunoblot e expressão gênica de microRNAs (miRNAs), por PCR em tempo real (qPCR). A concentração das EVs-plasma do grupo II (2,4x1010 EVs/mL) foi estatisticamente maior do que as do grupo I (5,9x109 EVs/mL). Já nas EVs-LCR a concentração foi semelhante nos dois grupos, TC/aids (2,9x109 EVs/mL) e OI/aids (4,8x109 EVs/mL). Apenas a concentração das EVs foi capaz de distinguir os pacientes com...(AU)

ABSTRACT

This study aimed to isolate and characterize EVs and compare them between groups of individuals with or without toxoplasmosis, a worldwide distribution zoonosis, that plays an important role during pregnancy and co-infection with the human immunodeficiency virus (HIV). Eighty-three samples was divided as group I, 20 plasma of health individuals and pregnant women (negatives for toxoplasmosis); group II, 21 plasma of toxoplasmosis patients; group III, 26 samples of cerebrospinal fluid (CSF) of patients with cerebral toxoplasmosis/aids (TC/AIDS) e group IV, 16 samples of CSF of patients without toxoplasmosis, but with AIDS and others opportunistic infections (OI/AIDS). After EV isolation by ultracentrifugation, size and concentration of were measured by Nano Tracking Analisys (NTA). In addition, morphology by Transmission Electronic Microscopy (TEM), protein profile by SDS-PAGE/Imunoblot and miRNAs expression, by Real time PCR (qPCR) were performed. Concentration of plasma EVs from group II patients (2.4x1010 EVs/mL) was statistically higher than those from group I (5.9x109 EVs/mL). Concentration od CSF EVs was similar in both groups, TC/AIDS (2.9x109 EVs/mL) and OI/AIDS (4,8x109 EVs/mL). Therefore, only the concentration was able to distinguish patients with toxoplasmosis than health individuals. Exosomes were also confirmed by TEM and CD-63 and CD-9 tetraspanina detection by immunoblot. EVs-plasma from group II had higher expression of miR-125b (4.9 times) and miR-146a (4.1 times) from control group...(AU)