Avaliação do efeito do tratamento quimioterápico sobre eventos celulares relacionados com a metástase no osteossarcoma / Evaluation of chemotherapy effect on cellular events related to metastasis in osteosarcoma

RESUMO

O osteossarcoma é o tumor maligno primário mais frequente do osso e afeta principalmente os ossos dos membros inferiores de crianças e adolescentes. Embora o tratamento quimioterápico seja realizado com a combinação de fármacos, como doxorrubicina (DOX), cisplatina (CIS) e metotrexato (MTX), os pacientes desenvolvem com frequência metástases e recidiva. A transição epitéliomesenquimal (EMT) é um processo no qual as células epiteliais sofrem alterações bioquímicas, assumindo o fenótipo de células mesenquimais, que pela maior capacidade migratória e maior potencial de invasão está relacionada com o desenvolvimento de metástases. O objetivo geral deste estudo foi investigar a ocorrência de metástase em pacientes portadores de osteossarcoma e avaliar o efeito do tratamento quimioterápico in vitro sobre processos celulares relacionados com a metástase. Especificamente, analisamos (i) o momento da ocorrência da metástase em pacientes portadores de osteossarcoma em relação ao tratamento quimioterápico; (ii) a expressão de biomarcadores de EMT (E-caderina, claudina-1, zona ocludina (ZO-1), snail, N-caderina, ß-catenina, slug e vimentina) em células primárias de osteossarcoma isoladas de seis pacientes antes e após o tratamento quimioterápico e (iii) o efeito in vitro de agentes farmacológicos utilizados em protocolos de quimioterapia do osteossarcoma sobre a expressão dos biomarcadores de EMT e sobre a migração celular em culturas primárias estabelecidas a partir de amostras tumorais. As metástases ocorreram em 57,5% dos pacientes, sendo que dentre estes em 73,7% ocorreu na vigência do tratamento quimioterápico. A identidade óssea das culturas primárias foi conferida pela expressão de osteoprotegerina. Não houve diferença na expressão dos marcadores de EMT antes e depois da quimioterapia. Embora sem significância estatística, houve redução na expressão do marcador snail, E-caderina e ZO-1. Os marcadores mesenquimais (E-catenina, slug) e epitelial (claudina-1) permaneceram estáveis ou aumentaram ligeiramente (N-caderina e vimentina) depois da quimioterapia. No experimento in vitro a maior expressão de N-caderina e de vimentina ocorreu nas células tratadas simultaneamente com todos os agentes. A maior expressão de snail e slug foi observada na exposição isolada ao metotrexato. A expressão de Ecatenina não diferiu entre os diferentes tratamentos. Embora os resultados do presente estudo não nos permitam avançar no conhecimento sobre os mecanismos que controlam e regulam a evolução clínica do osteossarcoma, acreditamos que demos o passo inicial no sentido de definir marcadores, que potencialmente possam ser utilizados na caracterização biológica das diversas variantes do osteossarcoma e, desta forma, atuar com maior precisão no acompanhamento clínico e biológico da doença

ABSTRACT

Osteosarcoma is the most common primary malignant bone tumor and affects mainly the bones of the lower limbs in children and adolescents. Although chemotherapy is carried out with a combination of drugs such as doxorubicin (DOX), cisplatin (CIS) and methotrexate (MTX), patients often develop metastasis and recurrence. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) is a process in which epithelial cells undergo biochemical changes, assuming the phenotype of mesenchymal cell with higher migration ability and increased potential for invasion and thus, to the development of metastasis. The aim of this study was to investigate the occurrence of metastasis in patients with osteosarcoma and evaluate the in vitro effect of chemotherapy on cellular processes related to metastasis. Specifically, we analyzed (i) the time of occurrence of metastasis in patients with osteosarcoma in relation to chemotherapy; (ii) expression of EMT biomarkers (E-cadherin, claudin-1, occludin zone (ZO-1), snail, N-cadherin, ß-catenin, slug and vimentin) in isolated osteosarcoma primary cells from six patients before and after chemotherapy and (iii) the in vitro effect of pharmacological agents used in chemotherapy protocols for osteosarcoma on the expression of EMT biomarkers and on cell migration both in primary cultures established from tumor samples. Metastasis occurred in 57.5% of patients and in 73.7% it took place during chemotherapy. Bone identity of primary cultures was conferred by osteoprotegerin expression. There was no difference in the expression of EMT markers before and after chemotherapy. Although not statistically significant, there was a reduction in the expression of markers snail, E-cadherin and ZO-1. The mesenchymal markers (ß-catenin, slug) and epithelial marker claudin-1 remained stable or increased slightly (N-cadherin and vimentin) after chemotherapy. In the in vitro experiment, most N-cadherin and vimentin expression occurred in cells treated simultaneously with all agents. The greatest expression of snail and slug was observed in isolated exposure to methotrexate. The ß-catenin expression did not differ between the different treatments. Although the results of this study do not allow us to advance in the knowledge about the mechanisms that control and regulate the clinical progression of osteosarcoma, we believe that we have taken the first step to define markers that may potentially be used in the biological characterization of the different variants of osteosarcoma and thus operate with greater precision in biological and clinical monitoring of the disease