Análise da expressão de microRNAs, receptores OX40 e CD40L, e do agregado de plaquetas-leucócitos no câncer gástrico / Analysis of the expression of microRNAs, OX40 and CD40L receptors, and platelets-leukocytes aggregation in gastric cancer

RESUMO

O prognóstico dos portadores de câncer gástrico tem melhorado pouco nas últimas décadas e o melhor entendimento das vias moleculares e as interações imunes no microambiente tumoral podem revelar novas possibilidades de tratamento. O ambiente tumoral é composto por células do sistema imune, que refletem a tentativa desse sistema em promover uma resposta antitumoral. Complexas interações entre células e mediadores imunes no microambiente tecidual regulam o crescimento de tumores, progressão, metástase e angiogênese. O entendimento das alterações da imunidade na população com câncer gástrico (CG) permitirá a intervenção terapêutica para melhorar a resposta à cirurgia e à quimioterapia. Objetivo: comparar a expressão de miRNA em tecidos de pacientes com câncer gástrico e controles saudáveis para encontrar miRNAs desregulados no câncer gástrico e usar ferramentas de bioinformática para determinar a possível influência desses miRNAs no sistema imunológico. Avaliar a formação de agregados plaquetas-leucócitos circulantes, bem como os níveis de ativação plaquetária (CD62p+, CD40L) desses conjugados a leucócitos em pacientes com CG. Quantificar a expressão de moléculas costimulatórias da resposta imune (OX40) em linfócitos T de pacientes com CG. Métodos: é um estudo do tipo corte transversal, exploratório e translacional realizado no Hospital de Câncer de Pernambuco, Laboratório de Pesquisa Translacional do Instituto de Medicina Integral Prof. Fernando Figueira e Centro Internacional de Pesquisa (CIPE) do AC Camargo entre 2015 a 2018. Foram avaliados 83 pacientes com câncer gástrico e 69 controles. Foram determinados os níveis de expressão de microRNAs no tecido tumoral gástrico em comparação aos da mucosa gástrica normal por técnica de reação em cadeia da polimerase (qPCR - TaqMan). Foram realizadas as análises dos niveis linfócitos T e B, OX40, CD40L e de agregado de plaquetas no sangue periférico por citometria de fluxo. Resultados: As análises revelaram um miRNA mais expresso (miR-196a-5p) e dois significativamente menos expressos (miR-374a-5p e miR-375) em comparação ao grupo controle. Pacientes com estádio IV (metástatico) apresentaram uma diminuição significativa na expressão do miR-374-5p quando comparados aos pacientes não metastáticos (p=0.03). Com uso de plataformas de bioinformática, foram observadas várias vias que sofrem influência dos microRNAs desregulados e que interagem com genes envolvidos com a resposta imune celular, moléculas de adesão celular e migração celular. Foram encontrados níveis elevados de expressão de OX40 em linfócitos T, monócitos e neutrófilos de pacientes com neoplasia gástrica (p<0.0001), entretanto, os níveis de OX40 foram reduzidos nos grupos com neoplasia estádio III/IV quando comparados ao estádio I/II. Observamos níveis elevados de agregados de plaquetas-linfócitos T e plaquetas-linfócitos B no sangue de pacientes GC com estágio IV quando comparados com os estágios I, II e III, e grupo controle (p <0,05). Níveis reduzidos de agregados plaquetas-linfócitos totais com expressão de CD40L foram observados no estádio IV da doença (p<0,05). Níveis elevados de plaquetas ativadas e agregados de plaquetas-monócitos ativados (CD62p+) foram observados em pacientes GC quando comparados ao grupo controle (p<0,05). Conclusão: Os resultados deste estudo permitem concluir que existem alterações de mecanismos moleculares (miRNA) e celulares envolvidos na regulação e ativação da resposta imune, sendo associadas à progressão e metástase no GC

ABSTRACT

The prognosis of gastric cancer patients has not been improved in the last decades and the the understanding of the molecular immune pathways and how immune interactions happens on tumoral microenvironment, open new possibilities of treatment. The tumor environment is infiltrated by cells of the immune system, which reflect an antitumor response. Complex interactions between microenvironmental cells and mediators regulate tumor growth, progression, metastasis and angiogenesis. The knowledge of the immunity in the population with gastric cancer will allow therapeutic intervention to improve the response to surgery and the chemotherapy. Objective: our primary goal was to compare the miRNA expression in tissues from primary gastric cancer patients and healthy controls to find miRNAs dysregulated in gastric cancer and used bioinformatics tools to determine potential roles of these miRNAs in the immune system. We conducted a secondary analysis to evaluate the formation of circulating platelet-leucocyte conjugates as well as the CD40L levels conjugate to leucocytes in GC and finally, samples were analysed for levels of costimulatory molecules related to the immune response (OX40) in GC. Methods: A cross-sectional, translational and exploratory study carried out at the Hospital de Cancer de Pernambuco, Translational Research Laboratory of the Instituto de Medicina Integral Prof. Fernando Figueira and AC Camargo International Research Center (CIPE) from 2015 to 2018, involving 83 patients with gastric cancer and 69 controls. Expression levels of microRNAs in gastric tumor tissue and normal gastric mucosa were determined by polymerase chain reaction technique (qPCR - TaqMan). Analyzes of T and B lymphocytes, OX40, CD40L and platelet aggregate levels were performed in peripheral blood by flow cytometry. Results: The results revealed a more express miRNA (miR-196a-5p) and two significantly less expressed (miR-374a-5p and miR-375) compared to the control group. Patients with stage IV (metastasis) showed a significant decrease in miR-374-5p expression when compared to non-metastatic patients (p = 0.03). Bioinformatics analysis suggested that the pathways regulated by these differentially expressed miRNAs were related to the immune response, cell adhesion, and cell migration. High levels of OX40 expression were found in T lymphocytes, monocytes and neutrophils of patients with gastric neoplasia (p <0.0001); however, OX40 levels were reduced in groups with stage III / IV neoplasia when compared to stage I / II. We observed higher levels of platelet-T lymphocyte aggregate (P-T lymp) and platelet-B lymphocyte aggregate (P-B lymp) in the peripheral blood (PB) of GC patients with stage IV when compare with stages I-II-III, and control group (p<0,05). Reduced levels of CD40L+ Platelet-total lymphocyte (P-lymp) were observed at stage IV of the disease (p<0.05). High levels of CD62p+ platelets and CD62p+ platelets-monocyte aggregate were observed GC patients when compare to control group (p<0.05). Conclusion: The results of this study allow us to conclude that there are alterations of molecular mechanisms (miRNA) and cellular mechanisms involved in the regulation and activation of the immune response and associated to the progression and metastasis in GC