Caracterización de la amplificación génica de un segmento de 294 bases del genoma de mycobacterium tuberculosis / Characterization of genic amplification of a segment of 294 bases of mycobacterium tuberculosis genoma

RESUMEN

Se presentan los resultados de una prueba diagnóstica novedosa, basada en la amplificación de una secuencia nucleótida conocida de un ADN blanco. La reacción de amplificación génica (PCR), descrita en este trabajo, permite una amplificación * 10 elevado a 6 -veces un segmento de 294 bp de un gene que codifica a un antígeno de 65 KDa- correspondiente a una proteína de respuesta al estrés térmico, presente en Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium bovis BCG. Esta reacción requiere grandes cantidades de ADN blanco, pero con la técnica utilizada fue posible detectar amplificación comenzando con 10 elevado a -12 g de ADN; cantidad que corresponde a 10-100 micobacterias/equivalentes ADN. Este nivel detectado representa un mejoramiento respecto a la tinción Ziehl-Neelsen, el cual necesita sobre 10.000 micobacterias para ser leído como positivo. La concentración de Mg elevado a +2 es crítica en la reacción, la cual corresponde a 3-5 mM. El análisis de la secuencia muestra que la amplificación de ésta es comparable a la secuencia localizada entre las posiciones 781-1075 del gene 65 KDa. Se realizaron pruebas específicas que demostraron que la señal de amplificación es posible de encontrar con ADN obtenido de M. tuberculosis y M. bovis BCG. Con otras micobacterias la señal de amplificación es muy baja y equivalente a aquéllas encontradas con ADN micobacterial no relacionado. La reacción fue probada con cuatro muestras clínicas, las cuales fueron positivas para la presentación de micobacterias; en tres de ellas se encontró el segmento amplificado 294 bp. Continúan desarrollándose ensayos de sensibilidad y especificidad en muestras clínicas