Development of an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of anti-native DNA antibodies using DNA from "Crithidia luciliae" as substrate

RESUMO

DNA de cinetoplasto de Crithidia luciliae (kDNA) foi isolado e purificado para desenvolvimento de ensaio imunoenzimático para detecçao de anticorpos anti-DNA nativo. O kDNA foi obtido por lise das células com dodecil sulfato de sódio (SDS) e pronase E e purificado por ultracentrifugaçao sobre soluçao de sacarose a 20 por cento e extraçao protéica. A pureza do kDNA foi verificada pela razao de densidades ópticas a 260 e 280nm e por eletroforese em gel de agarose, após digestao com as enzimas de restriçao HindIII e HaeIII. DNA de timo de vitelo, DNA plasmidial bacteriano e DNA cromossômico de Micrococcus lysodeikticus foram também empregados como substrato para ELISA. Foram testados 158 soros de pacientes atendidos no ambulatório da Disciplina de Reumatologia da Escola Paulista de Medicina, UNIFESP, sendo 65 com lúpus eritematoso sistêmico (LES), 30 com artrite reumatóide, 27 com esclerose sistêmica e 36 com outras doenças reumáticas auto-imunes. Foram também testados 105 soros obtidos de pacientes que estavam sendo investigados quanto a apresentarem LES e 30 soros de controles sadios. Nossos resultados mostraram que o kDNA pode ser purificado e utilizado com sucesso como substrato alternativo em ELISA. Entretanto, o mesmo nao ocorre com DNA cromossômico obtido de M. lysodeikticus, mostrando a necessidade de avaliaçao cuidadosa da fonte de DNA para detecçao de anticorpos anti-DNA, em testes imunoenzimáticos