Caracterizção molecular de um antígeno de 30kDa de Leishmania (L) amazonensis envolvido na resposta imune celular em modelo urino / Molecular characterization of a 30kDa antigen of Leishmania (L) amazonensis involved in cellular immune response in murine model

RESUMO

O enfoque do presente trabalho foi a caracterizaçao molecular de um antígeno de 30 kDa (p3O) de formas amastigotas de L. (L.) amazonensís implicado em respostas linfoproliferativas em camundongos BALB/c parcialmente protetoras contra a infecçao homóloga. A caracterizaçao do antígeno envolveu a produçao de anticorpos monoclonais dirigido à p3O e entre eles um, denominado AcMo 2E5/D3, mostrou-se reativo tanto com formas amastigotas quanto promastigotas de L. (L.) amazonensis. A utilizaçao do AcMo 2E5/D3 em estudos de imunocitoquímica em nível de microscopia eletrônica de cortes ultrafinos de lesoes de pata de hamster infectados com L. (L.) amazonensis mostrou a localizaçao preferencial da p3O em megassomos dos parasitas. Foi demonstrada a atividade de cisteína proteinase da p3O após purificaçao do antígeno em coluna de imunoafinidade com o AcMo 2E5/D3 e separaçao por PAGE-SDS em gel contendo gelatina em condiçoes nao redutoras. Um fragmento do gene codificador da p3O, denominado Lacys23, foi obtido por amplificaçao por PCR utilizando-se oligonucleotídeos conservados de cisteína proteinases e DNA genômico de L. (L.) amazonensis, sendo posteriormente seqüenciado. A análise da seqüência desse fragmento mostrou alto grau de homologia com genes que codificam cisteína proteinases previamente descritas, assim como uma grande identidade com as cisteína proteinases expressas por essas seqüências. A análise genômica do Lacys23 mostrou que provavelmente o gene está presente em pequeno número de cópias e em um único locus cromossômico. A subclonagem do fragmento Lacys23 no vetor de expressao PGEX em fase com o gene da glutationa S-transferase gerou uma proteína de fusao de 43 kDa (p43). Essa proteína foi reconhecida por soro hiperimune anti-amastigotas de L. (L.) amazonensís e a reaçao de extratos do parasita com soro de camundongo anti-p43 identificou uma proteína de 30 kDa com atividade proteolítica muito semelhante à da p3O nativa. A proteína recombinante foi capaz de induzir respostas proliferativas de linfócitos de camundongos BALB/c previamente imunizados com amastigotas de L. (L.) amazonensis comparáveis à da p3O nativa. A secreçao de IFN-g pelos linfócitos estimulados pela p43 também foi observada, sugerindo o envolvimento de linfócitos CD4+ Th1 nessas respostas. Camundongos BALB/c foram imunizados com a forma nativa e recombinante da p3O e desafiados com L. (L.) amazonensís. Resultados prévios mostraram a capacidade ...(au)