Receptores muscarínicos em cêlulas de sertoli de rato / Muscarinic acetylcholine receptors in sertori cells

RESUMO

O objetivo do presente trabalho foi caracterizar os receptores muscarínicos nas células de Sertoli de rato. Cultura primária de células de Sertoli foram obtidas de ratos com 30 dia de idade. O ensaio da transcriptase reversa seguido da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) foi realizado com DNA complementar obtido a partir do RNA mensageiro das células de Sertoii e primers específicos para os cinco subtipos de receptor muscarínico. Foram amplificados a produtos de tamanhos específicos correspondendo aos cinco subtipos m1 = 641 -, m2 = 552; m3 = 790; m4 = 51O e m5 = 451 pares de bases. Pelo ensaio de proteção à ribonuclease (RPA), utilizando ribosondas produzidas a partir de sequência distinta entre os cinco subtipos de receptores muscarínicos, localizada na terceira alça intracitoplasmática do receptor, foram detectados quatro transcritos para os receptores muscarínicos, correspondentes aos subtipos m1 = 377; m2 = 547; m3 = 687 e m4 = 519 nucleotídeos. Nas condições utilizadas neste último ensaio, o transcrito m5 não foi detectado. Os estudos de saturação foram realizados em células de Sertoli incubadas com o [3H]Quinuclidinyl benzilate ([3H]QNB) (O,1 nM a 4 nM), por 2 horas a 4§ C, na ausência (ligação total) e na presença (ligação inespecífica) de atropina (l nM). A ligação do [3H]QNB às células de Sertoli foi específica, saturável, dependente de tempo e temperatura de incubação. A análise de Scatchard revelou a presença de um único sítio de ligação para o @HIQNB, com uma constante de dissociação (KD = 1,78 ñ O,32 nM) e densidade de receptores (Bmax) = 221,0 ñ 20,0 fmol/mg de proteína. O antagonista muscarínico, atropina (não seletivo), deslocou a ligação específica do [3H]QNB e a melhor curva que se ajustou aos dados foi uma sigmóide complexa, com um coeficiente de Hill de O,47 ñ O,09, sugerindo a presença de mais de um sítio de ligação e/ou estado de afinidade diferente de um mesmo sítio de ligação. Os valores de PKi para a atropina foram 7,9 ñ O,80 e 3,3 ñ O,23. O acúmulo intracelular de AMP cíclico induzido pelo forskolin (lO-5 M) foi determinado na ausência e presença do carbacol (lO-3 M) e diferentes antagonistas muscarínicos. O forskolin, que estimula diretamente a enzima adenililciclase, produziu um aumento, dependente da concentração, no conteúdo intracelular de AMP cíclico. O aumento de AMP cíclico, induzido pelo forskolin (1O-5 M), foi reduzido pelo carbacol 10-5M, 10-4M e 10-3 M de 23 por cento,...(au)