Evaluación de métodos de marcación radioactivos y no radioactivos en la elaboración de sondas diagnósticas de malaria / Evaluation of radioactive and non radiactive labelling methods in the elaboration of malaria diagnostic probes

RESUMEN

El diagnóstico eficiente y rápido es el primer paso importante en el control epidemiológico de la malaria. Es por esto que se ha sugerido la necesidad de explorar nuevos procedimientos de detección, que superen las limitaciones presentadas por el examen microscópico empleado para tal fín. Por esta razón, en este trabajo se evaluaron métodos de marcación radioactivos y no radioactivos, empleados en la producción de sondas para el diagnóstico a nivel epidemiológico de P. falciparum y P. vivax. Se evaluaron además las condiciones óptimas de hibridización, la preparación de las muestras y las sondas utilizadas. Dentro de los métodos de marcación radioactivos probados, la reacción Random Primers, resultó mejor que Nick Translation, obteniéndose mejores incorporaciones de [a superíndice 35 S]dATP, resultando en sondas con mayor actividad específica (1-2X10 superíndice 9). Se logró un sensibilidad 10 veces mayor en la detección de ADN de P. falciparum, empleando el sistema Random Primers, con respecto a la obtenida con Nick Translation, y de esta forma se alcanzaron los niveles reportados en la literatura. La sensibilidad alcanzada (12 pg), se logró tanto con la sonda p38R desarrollada y caracterizada en nuestro laboratorio, como con la sonda pRepHind, una de las más utilizadas en los laboratorios de otros paises, aumentando el interés en conocer más a fondo el clon p38R. El método de marcación no radioactivo con Fotobiotina, mostró ventajas sobre la marcación con Biotina, y se alcanzó la misma sensibilidad de 135 pg de ADN de P. falciparum. Utilizando los oligonucléotidos 21mer y 25mer para detectar P. falciparum y P. vivax respectivamente, maracados con Terminal Transferasa, en nuestros experimentos no resultaron buenas sondas de diagnóstico. También se probó como método de detección no radioactivo, el sistema de generación de señales fluorescentes, mediante el empleo de proteasas, logrando en un ensayo preliminar de sensibilidad detectar 13 pg de P. falciparum. Aunque este sistema tiene problemas de señales inespecíficas que deben solucionarse, los resultados preliminares muestran sus posibilidades como método de detección