Citometria de fluxo, imunocitoquimica e western blot na detecção da expressão da proteína p53 em células tumorais: uma análise comparativa / Flow cytometry, immunocytochemistry and western blot in measurement of p53 protein expression in tumor cells: a comparative analysis

RESUMO

Introdução e objetivos: p53 é a proteína cuja função é crucial no controle do ciclo celular, reparo do DNA e indução de apoptose de células geneticamente instáveis. O Western Blot (WB) e a imunocitoquímica (ICQ) são atualmente os métodos de detecção mais empregados da proteína p53, se tratando, porém de técnicas de execução demorada e trabalhosa. O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma metodologia rápida para detecção e quantificação da proteína p53 em células tumorais através da citometria de fluxo (CF). Material e métodos:Empregou-se 14 linhagens de células tumorais humanas Namalva, Raji e Daudi (linfoma de Burkitt), C91 e MT-2 (leucemia de células T do adulto), Jurkat (leucemia linfoblástica de células T), HL-60 (leucemia promielocítica), HT-29 (adenocarcinoma de colon), GLC-4 (carcinoma de pulmão), MCF-7 (carcinoma de mama), H460 e H460/bcl-2 (carcinoma de células não pequenas de pulmão), k562 e lucena (leucemia mielóide crônica em crise blástica) e C6 (astrocitoma originária de rato). Paralelamente, linfócitos provenientes de 36 indivíduos sadios serviram como controle da reação negativa. A iCQ foi realizada pelo método da imunoperoxidase indireta, a CF por marcação direta com anticorpo monoclonal anti-p53 diretamente conjugado ao isotiocianato de fluoresceína após permeabilização celular e o WB através do método padrão. A quantificação antigênica foi realizada através da média de intensidade de fluorescência na CF e densitometria no WB. Resultados: Observou-se uma correlação direta entre os resultados da CF, WB e ICQ, com expressão positiva nas linhagens Namalva, Raji, HT-29, GLC-4, MT-2, C91pl, MCF-7, H460 e H460/bcl-2 e negativa nas demais linhagens e em todas as células do grupo controle. A ICQ foi eficaz na demonstração da presença da p53 no núcleo da célula e a CF e WB permitiram também a quantificação antigênica, evidenciando células com variados níveis de expressão antigênica. A CF quando comparada ao WB apresentou maior sensibilidade. Conclusões: Nossos resultados mostraram que a proteína p53 pode ser detectada em células tumorais através da CF. Esta metodologia é eficaz, sensível e prática, podendo ser empregada rotineiramente em estudos de expressão da proteína p53 em células tumorais.