Expressão funcional e caracterização da serina protease do vírus da dengue / Functional expression and characterization of the serine protease of dengue virus

RESUMO

Dengue(DEN)hoje é a mais importante doença viral transmitida por mosquitos(arbovirose)nos países tropicais e subtropicais atingindo pelo menos 100 milhões de indivíduos a cada ano.A doença é causada por qualquer um dos 4 sorotipos do vírus da dengue(DEN-1,-2,-3,–4), membros da família Flaviviridae,gênero Flavivírus.Ainda não existe disponível uma vacina ou drogas antivirais específicas para o controle da infecção por DEN.O vírus da DEN possui uma serina protease,codificada pelos 185 primeiros aminoácidos da região N-terminal da proteína não-estrutural 3(NS3pro).Esta enzima...A NS3pro requer a interação com...poderia ser uma alternativa para o bloqueio da infecção viral.Levando em conta o sucesso obtido com os inibidores de protease do HIV e HCV decidimos investir na expressão funcional do complexo da serina protease dos vírus da dengue(DEN1 e DEN2),formado pela co-expressão do cofator e da protease.Obtivemos sucesso na expressão funcional da serina protease de DEN2,que apresentou atividade quando testada em substratos quimicamente sintetizados e com parâmetros de cinética de hidrólise semelhantes aos obtidos com uma outra serina protease de DEN2(cepa NGC)já bem caracterizada.Atualmente estamos caracterizando funcionalmente a enzima de DEN1.A obtenção de complexos da protease funcionalmente ativos é fundamental para estudos visando a determinação da estrutura tridimensional da enzima na presença de diferentes inibidores,potenciais candidatos a drogas antivirais. Somado a isto,construímos diversos complexos da protease quiméricos(cofatorDEN1/proteaseDEN2, cofatorDEN2/proteaseDEN1 e cofatorFA/proteaseDEN2),a fim de estudarmos a especificidade do cofator em relação a interação com a NS3pro de diferentes sorotipos ou outros flavivirus.Testes funcionais,utilizando peptídeos sintéticos correspondentes as regiões de clivagem da poliproteína viral foram realizados.A proteína quimérica DEN1co/DEN2pro apresentou atividade nos ensaios realizados,clivando os substratos em cis e em trans da poliproteína viral de DEN1.A partir desses dados é possível especular que o cofator possa servir de alvo para o desenvolvimento de uma droga capaz de interferir no mecanismo de ação,isto é na interação com a NS3. Estamos atualmente testando as outras quimeras com diferentes substratos e esperamos que os dados dos ensaios funcionais possam validar nossa hipótese em breve.Como perspectiva a curto prazo,os complexos da protease ativos serão utilizadas para estudos de cristalografia.