Molecular cloning of rotavirus genome

RESUMEN

Los rotavirus son los principales agentes responsables de las gastroenteritis virales humanas y animales. La identificación y caracterización de su genoma es necesaria para la comprensión de esta patología así como para el desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico y, eventualmente, para la preparación de antígenos virales utilizando técnicas de DNA recombinante. Estos virus poseen un genoma formado por once fragmentos de RNA doble cadena (cd). Aquí se describe la construcción de bancos de cDNA para rotavirus bovino y humano, ambos purificados de materia fecal. Los cDNA fueron preparados por síntesis in vitro utilizando transcriptasa reversa sobre los RNAs genómicos virales, previamente poliadenilados en sus extremos 3. Los cDNAs fueron ligados a un vector plasmídico y propagados en E. coli. Se obtuvieron genotecas correspondientes a los virus bovino y humano con 500 y 100 recombinantes respectivamente. Análisis de restricción de algunos clones permitieron establecer el tamaño de los insertos correspondientes a los distintos segmentos genómicos virales. Dos de estos clones fueron caracterizados, determinándose que contienen las secuencias completas de los fragmentos 10 y 8 del virus bovino. La utilización de estos clones como sondas radioactivas nos permitió diagnosticar la presencia de rotavirus en muestras de materia fecal mediante la detección de los correspondientes RNAs. Este ensayo pudo ser utilizado para la detección viral en muestras infectadas provenientes de distintas especies