Purificação e utilização das condroitinases B e AC de Flavobacterium heparinum no estudo dos proteoglicanos de matriz extracelular / Purification and utilization of chondroitinases AC, B and C from Flavobacterium in the study of proteoglycans the extracellular matrix

RESUMO

As condroitinases AC, B e C de Flavobacferium heparinum são importantes instrumentos para a identificação e a análise da estrutura de condroitim sulfatos e dermatam sulfatos, bem como de seus proteoglicanos, de diferentes origens. Entretanto, para que sejam úteis, preparações de enzimas puras e estáveis devem ser obtidas. No presente trabalho, descrevemos um procedimento simples, reprodutível e com alto rendimento para preparo dessas enzimas, baseado em cromatografia de troca iônica em Q-Sepharose FF e cromatografia de interação hidrofóbica em Pheny-Sepharose HP. Para análise quantitativa da purificação e do rendimento das enzimas purificadas, estabelecemos uma metodologia que se baseia na queda em metacromasia que acompanha a despolimerização dos glicosaminoglicanos. Este método, que utiliza a interação dos glicosaminoglicanos com azul de dimetilmetileno, permitiu a dosagem das condroitìnases presentes em extratos brutos induzidos de F. heparinum e nas preparações purificadas. A vantagem deste procedimento sobre outros métodos comumente empregados, que quantificam os produtos insaturados formados, é que a. presença de glicuronidases e sulfatares não interfere na determinação das atividades enzimáticas. As condroitinases AC e B assim preparadas foram empregadas na identificação e na análise estrutural de proteoglicanos e glicosaminoglicanos extraídos de diversos tecidos e fluidos biológicos, como córnea humana, urina, soro e diversos tecidos de gato, miométrio e leiomioma humanos. Além disso, uma nova metodologia foi desenvolvida para imunolocalizar proteoglicanos de condroitim sulfato ou dermatam sulfato em cortes de tecidos. Essa metodologia baseia-se na incubação de cortes de tecidos com condroitinase AC (para condroitim sulfato) ou condroitinase 8 (para dermatam sulfato). Em seguida, os resíduos insaturados gerados pelas enzimas são reconhecidos por anticorpos monoclonais específicos. Estudos de dupla marcação para as cadeias de condroitim sulfato ou dermatam sulfato e o esqueleto protéico (decorim ou versicam) ou queratam sulfato ou, ainda, filamentos de actina foram também realizados. As imagens de dupla marcação foram submetidas a análise morfométrica, utilizando a ferramenta MATLAB, para determinação do grau de co-localização...