Clonagem, caracterização e expressão heteróloga de uma calnexina homóloga do fungo patogênico Paracoccidioides brasiliensis / Cloning, characterization and heterologue expression of a calnexin homologue from the pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis

RESUMO

Descrevemos neste trabalho a clonagem do cDNA de, que codifica uma calnexina homóloga do retículo endoplasmático de Paracoccdiioides brasiliensis. Esta chaperone reconhece especificamente glicoproteínas monoglicosiladas no retículo endoplasmático, sendo assim um componente essencial para o processo de dobramento de glicoproteínas nascentes que serão secretadas. A fase aberta de leitura da PbCnx foi encontrada num fragmento de 1.701 pares de bases (pb) que codifica uma proteína de 567 resíduos de aminoácidos, com massa estimada em 62.680 Da. A seqüência deduzida de aminoácidos compartilha identidade com as sequências descritas das calnexinas de Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger e apresenta vinte potenciais sítios de fosforilação e dois de glicosilação. Além disso, esta seqüência deduzida de aminoácidos apresenta um extraordinário grau de conservação, especialmente numa região central, denominada domínio central altamente conservado (hcd) que contém, como uma 'marca', sequências repetidas KPEDWD; estas sequências são consideradas sítios ligantes de cálcio de alta afinidade e são encontradas em todos os membros da família das calnexinas e calreticulinas. A análise das hibridações por Southem e Northem blots, mostraram que a proteína é codificada por um único gene ou gene de poucas cópias. O cDNA que codifica PbCnx foi expresso como proteína recombinante em Escherlchia colí. A proteína recombinante purificada foi reconhecida por soros de paciente com paracoccidioidomicose (forma crônica). Foi gerado também um soro policlonal monoespecífico, a partir da proteína recombinante de fusão, utilizado para a localização celular da proteína, através de microscopia confocal. O padrão de marcação observado por imunofluorescência mostra a proteína intensamente distribuída na região citosólica da célula. Além disso, este soro policlonal reconheceu especificamente a calnexina nativa através de ensaios de immunoblotting do extrato total de células leveduriformes de P. brasilíensis.