Indução da ovulação em vacas com gonadotrofina coriônica humana (hCG) purificada por cromatografia de afinidade / Induction of ovulation in cows with affinity chromatography-purified Human Chorionic Gonadotropin (hCG)

RESUMO

O objetivo do presente estudo foi purificar o hCG contido em uma preparação comercial (Pregnyl® Organon) por cromatografia de afinidade e avaliar a taxa de ovulação de vacas injetadas com o hormônio purificado. Uma coluna de cromatografia contendo matriz de Concanavalina-A Sepharose (Con-A) foi equilibrada e cem milunidades internacionais (UI) de Pregnyl® foram aplicadas na coluna. Frações de 3,8mL foram colhidas (4 º C) a cada 5 minutos durante 12,5 horas, resultando em um total de 150 frações. Após a fração 76 adicionou-se à coluna solução tampão contendo 0,3M de alfa−metilglicosidase. A concentração protéica das frações foi estimada por espectrofotometria (280nm). Foram observados dois picos de absorbância, um entre as frações 14 e 19 e outro entre as frações 90 e100. As frações 14 a 19 e 90 a 150 foram reunidas seqüencialmente aos pares, concentradas por ultrafiltração e analisadas por SDS-PAGE. O primeiro pico resultou da eluição das proteínas não adsorvidas pela matriz de Con-A, enquanto o segundo representou as proteínas adsorvidas pela coluna, especialmente o hCG. As frações contendo hCG foram reunidas em uma única amostra cuja concentração protéica foi quantificada pelo método de Lowry. Vacas no 5º dia de um ciclo estral sincronizado, apresentando um folículo dominante maior que 8mm de diâmetro, foram injetadas com 0,1, 0,2 ou 0,3mg de proteína contida na amostra purificada. Após 48 horas, a taxa de ovulação observada foi de 0%, 50% e 75%, respectivamente. Foi demonstrado no presente estudo que a técnica de cromatografia por afinidade foi eficiente para aumentar a concentração relativa do hCG preservando sua atividade biológica.

ABSTRACT

Objective of the present study was to purify hCG contained in commercial preparation (Pregnyl®- Organon) by affinity chromatography and to evaluate ovulation rates in cows injected with the purified hormone. A chromatography column containing concanavalin-A sepharose (Con-A) matrix was equilibrated and one hundred thousand international units (UI) of Pregnyl® were applied to the column. Fractions of 3,8mL were collected (4 degree C) every 5 minutes for 12,5h, to yield a total of 150 fractions. After fraction 76, a column buffer containing 0,3M alpha-methylglicoside was added to the column. Protein concentrations were estimated by espectrophotometry(280nm). Two peaks of absorbance were observed, between fractions 14 and 19, and fractions 90 and 100. Fractions 14-19 and 90-150 were sequentially grouped in pairs concentrated by ultrafiltration andanalyzed by SDS-PAGE. The first peak of absorbance resulted from proteins contained in the commercial product, eluted from the column and not adsorbed by the Con-A matrix. The second peak represented proteins adsorbed by the column, especially hCG. The fractions containing hCG were grouped in a single sample and protein concentration was measured by the Lowry method. Cows in day 5 of the estral cycle, which had a dominant follicle larger than 8mm, were injected with 0,1, 0,2 or 0,3mg protein of the purificated sample. The ovulation rate 48 hours after treatment was 0%, 50% and 75%,respectively. It was demonstrated that relative concentration of hCG can be increased by affinity chromatography and biological activity of purified hCG was satisfactory preserved.