Cisteína-proteinases em promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis / Cysteine-proteinases in promastigotes of Leishmania (Viannia) braziliensis

RESUMO

No presente trabalho foram detectadas cisteína-proteinases (CPs) em promastigotas infectivas de Leishmania (Viannia) braziliensis. A estratégia de purificação consistiu na associação do método de extração por Triton X-114 com cromatografia em coluna de Concanavalina A-Sepharose, seguida por outra de DEAE-Sephacel. No ensaio das cromatografias, observamos um picomajoritário de atividade enzimática na presença do substrato pEFLpNan (165 x 10 (elevado a -32) (miu)M de pNan/minuto) para cerca de 10(elevado a 10) parasitas, coincidente com o pico majoritário da proteína eluído da coluna de troca iônica. A análise por SDS-PAGE do material eluído da coluna de troca iônica mostrou quatro principais bandas de proteínas com massas moleculares relativas de 63, 43, 30 e 27kDa. Os ensaios da atividade enzimática após eletroforese mostraram que as bandas de 63 kDa e 43 kDa, hidrolisam substratos como gelatina em pH 7,0 e são sensíveis de E-64. Além disso, as duas enzimas são capazes de hidrolisar o substrato pEFLpNan 63 kDa (2,2(mais ou menos) 0,3(miu)M de pNan/minuto) e 43 kDa (0,05(mais ou menos) 0,2(miu)M de pNan/minuto), e são inibidas por 10(miu)M E-64 (47por cento e 36por cento, respectivamente). Os ensaios de reconhecimento imunológico utilizando um anti-soro policlonal específico contra cisteína-proteinase B [anti-CPB de L. (L.) mexicana] revelaram que as enzimas de 63 kDa e 43kDa são reconhecidas por este anti-soro. Os experimentos de aglutinação, citometria de fluxo e imunocitoquímica utilizando esse mesmo antisoro revelaram que homólogos de CPBs estão localizados na superfície da membrana de promastigotas. Além disso, a incubação dos promastigotas com fosfolipase C (PLC) reduziu o número de células positivas para os homólogos de CPB. Os anti-soros anti-CRD (cross reactive determinat) e anti-CPB reconhecem bandas de 63 kDa e 43 kDa do sobrenadante das células tratadas com PLC em ensaios de immunoblotting sugerindo que isoformas destas...intracelulares.