Avaliação da técnica Nested-PCRTbU para aplicação no diagnóstico da peste / Evaluation of Nested-PCRTbU technique for application in the diagnose of pestis

RESUMO

O diagnóstico de certeza da peste baseia-se na identificação e isolamento da Y. pestis pelo cultivo de material de pacientes humanos, de roedores e suas pulgas. No Brasil, os casos humanos e as epizootias de peste ocorrem em locais distantes dos centros de diagnóstico. A competição com a flora cadavérica das carcaças de roedores e procedimentos inadequados de conservação e transporte das amostras aos laboratórios pode resultar na morte do bacilo e resultados falso-negativos. As técnicas moleculares apresentam-se como alternativas para estas situações, particularmente técnicas baseadas em PCR. No presente trabalho foi otimizada para o diagnóstico da peste a técnica N-PCRTbU que se baseia na separação física dos primers por imobilização dos primers internos na tampa do microtubo, dispensando a abertura do mesmo entre as duas etapas de amplificação, o que reduz a possibilidade de falsopositivos pela contaminação cruzada durante a manipulação dos amplicons no Nested-PCR convencional. Dois pares de primers, dirigidos ao gene estrutural (caf1) do antígeno F1 de Y. pestis (um par com homologia a uma região mais externa ao alvo e outro com homologia a uma região mais interna), foram inicialmente testados individualmente por PCR e depois por N-PCR tendo sido obtidos segmentos de tamanho esperado. Foram estabelecidas as concentrações de Taq DNA polimerase, dNTPs e MgCl2, bem como a proporção entre os primers externos e internos para o N-PCRTbU. Nos ensaios para estabelecimento do limiar de detecção a partir de DNA total e da cultura da cepa Y. pestis P. PB 881 a N-PCRTbU foi capaz de detectar respectivamente 10 pg de DNA e 20 bactérias viáveis. Baços de camundongos "Swiss Webster" infectados experimentalmente com a cepa Y. pestis P. PB 881 e amostras de baço, fígado, pulmão e coração conservadas no meio de Cary-Blair por 11 meses foram analisadas em paralelo por cultivo em gelose peptonada e pela técnica NPCRTbU. O fragmento de tamanho esperado (460pb) foi amplificado em todas as amostras mesmo nas que se revelaram multicontaminadas ou negativas pela cultura. Nos ensaios com DNA de outras espécies do gênero Yersinia Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica e com baços de camundongos não infectados com a Y. pestis não houve amplificação. Além da especificidade e sensibilidade, como os resultados podem ser obtidos rapidamente, em menos de 24 horas, a N-PCRTbU poderá ser mais uma opção em situações emergenciais [...]