Diferenciação molecular de moluscos do gênero Lymnaea (Gastropoda, Lymnaeidae) utilizando a PCR-RFLP e o estudo da variabilidade genética de L. columella pela RAPD / Molecular differentiation of clams of the genus Lymnaea (Gastropoda, Lymnaeidae) using PCR-RFLP and the study of genetic variability of L. columella by RAPD

RESUMO

Os moluscos do gênero Lymnaea são hospedeiros intermediários da Fasciola hepatica agente etiológico da fasciolose, parasitose de importância médica e veterinária. No Brasil já foram reportadas as espécies L. columella, L. viatrix, L. rupestris, L. cubensis. A identificação morfológica desses moluscos é feita com base na comparação dos caracteres da concha, aparelho genital e sistema renal. Entretanto, essa identificação é dificultada, principalmente, pela semelhança inter-específica dos caracteres morfológicos, além do tamanho reduzido dos exemplares que complica o processo de dissecação e a observação dos caracteres diagnósticos. Com o objetivo de contornar esses problemas, introduzimos a técnica PCR-RFLP (reação em cadeia da polimerase e análise de polimorfismos de tamanho de fragmentos de restrição) direcionada para as regiões ITS2 (espaçadora transcrita interna dois do gene codificador do RNA ribossomal) e 16S (gene mitocondrial RNA ribossomal) como ferramenta auxiliar na identificação dos limneídeos. Foram utilizadas as seguintes espécies: L. columella (Brasil, Guadalupe e Venezuela), L. viatrix (Brasil e Uruguai) L. diaphana (Argentina), L. cubensis (Martinique, Cuba e Guadalupe) e L. truncatula (França). A técnica da PCR-RFLP direcionada para a região ITS2 com a enzima HaeIII foi a que gerou resultados mais satisfatórios, permitindo separar todas as espécies. A PCR-RFLP mostrou-se uma importante ferramenta taxonômica confirmando a sistemática morfológica clássica de L. columella e L. diaphana. Devido à semelhança morfológica e proximidade genética entre L. viatrix, L. cubensis e L. truncatula, propomos um agrupamento dessas espécies em um complexo denominado complexo Lymnaea truncatula. Utilizando essa técnica, foi possível observar que as populações de Rio Acima (Minas Gerais, Brasil) e de Belo Horizonte (Minas Gerais, Brasil) apresentaram perfis espécie específicos idênticos, respectivamente, a L. truncatula e a L. cubensis. Este achado representa o primeiro encontro de L. truncatula no Brasil e de L. cubensis em Minas Gerais. Para avaliarmos a variabilidade genética de L. columella, empregamos a técnica RAPD. Neste estudo utilizamos somente L. columella devido a sua grande importância como hospedeira da F. hepatica no Brasil, responsável pela maioria dos focos da fasciolose no país.. A análise de variância molecular (AMOVA) e de similaridade pelos coeficientes de Dice e Jaccard foram os métodos utilizados para estimar a estrutura genética de L. columella. Observamos que essa espécie caracteriza-se por uma heterogeneidade inter-populacional e uma homogeneidade intra-populacional, relacionadas, provavelmente, com o mecanismo reprodutivo (auto-fecundação), ampla distribuição e dinâmica populacional.