Expressão da proteína VP6 de rotavírus A em sistemas eucariotos: células de mamífero e células de inseto / Expression of rotavirus VP6 protein in the eukaryotic systems, mammalian cells and insect cells

RESUMO

Os rotavírus A (RV-A) são os principais agentes causadores da gastroenterite infantil, sendo responsáveis por cerca de 600.000 mortes a cada ano no mundo. A proteína VP6 apresenta epítopos conservados entre as diversas estirpes de RV-A, o que a torna o antígeno de eleição para ensaios de diagnóstico. Além disso, a proteína VP6 representa um antígeno em potencial para o desenvolvimento de uma vacina contra RV-A baseada em subunidade viral. O objetivo deste estudo foi expressar a proteína VP6 de RV-A humano nos sistemas eucariotos, células de mamífero e células de inseto. Assim, o gene VP6 de RV-A humano foi subclonado no vetor de expressão pCl-neo, gerando a construção pCl-neo VP6. Essa construção foi utilizada para expressar a proteína VP6 recombinante (VP6r), de forma transitória, em células embrionárias de rim humano transformadas com o antígeno T do vírus símio 40 (HEK293-T). A VP6r manteve a capacidade de oligomerizar-se em trímeros e sua distribuição sugeriu a formação de estruturas semelhantes a túbulos. A cromatografia de imunoafinidade foi utilizada para purificar a VP6r a partir dos extratos de células HEK293-T. Entretanto, acredita-se que o baixo nível de expressão impossibilitou a purificação da VP6r. Alternativamente, optou-se por transfectar células de ovário de hamster chinês deficientes do gene da diidrofolato redutase (CHO Dhfr negativo) e obter clones estáveis expressando a VP6r. Assim, o gene VP6 foi subclonado no vetor de expressão pMBM, gerando a construção pMBMVP6. Células CHO Dhfr negativo foram transfectadas com a construção pMBMVP6 e clones celulares resistentes ao mesmo de seleção foram isolados...