Estandarización de un método de detección molecular del virus influenza (H5N1) de alta patogenicidad / Standardization of a molecular detection method of highly pathogenic avian influenza virus (H5N1)

RESUMEN

El virus de la influenza aviar H5N1 de alta patogenicidad mantiene el alerta mundial debido a su potencial zoonótico y pandémico. Surge entonces la necesidad de contar con herramientas para la detección temprana y de esta forma reducir el impacto potencial a la salud humana y animal. En este estudio se estandarizó un método de detección molecular de los genes de la matriz (M), hemaglutinina (H5) y neuraminidasa (N1) del virus de la influenza aviar H5N1 de alta patogenicidad de linaje asiático, mediante transcripción-reversa y reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RRT-PCR). A partir de un ARN viral de referencia cepa A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) se construyeron controles positivos mediante clonación de productos de PCR. Los estándares de naturaleza plasmídica se emplearon en la obtención de curvas estándar para determinar los límites de detección de la técnica. La sensibilidad observada para todos los genes analizados fue de 10² copias de ADN/μL. Las curvas mostraron una eficiencia superior al 90%, y R²>0,99. Este método puede ser útil en las campañas de monitoreo del virus en aves migratorias, así como para el tamizaje de muestras clínicas de humanos, en una emergencia de salud.

ABSTRACT

Highly pathogenic avian influenza virus (HPAI) H5N1 is a global threat due to its zoonotic and pandemic potential. Then, concern arises and the need to have early detection tools to minimize the impact on human and animal health. In this work, a molecular detection method was implemented to detect matrix (M), hemagglutinin (H5) and neuraminidase (N1) genes of HPAI avian influenza virus H5N1, based on real time RT-PCR (RRT-PCR). Positive controls were constructed from reference RNA viral A/Vietnam/1203/2004 (H5N1), cloned into plasmidic vectors and sequenced. Assay detection sensitivity was assessed with standard curves for each gene. Assay sensitivity was 10² DNA copies/μl in all cases. Curves showed amplification efficiency higher than 90% and R²>0.99. This method could be useful for bird monitoring campaigns and as a screening procedure for clinical samples.