Estudo funcional do gene PAWR/Par-4 (Prostate apoptosis responde-4) em células de mama normais e tumorais / Functional study of gene PAWR/Par-4 (Prostate apoptosis response-4) in normal and cancer breast cells

RESUMO

O câncer de mama é o tumor mais incidente entre as mulheres no mundo. Assim como em outros tumores, a tumorigênese nas mamas é um processo complexo resultante da combinação de fatores genéticos e ambientais que dirigem a transformação das células normais em células malignas. O gene PAWR, conhecido como PAR-4 (Prostatic apoptosis response-4) foi primeiramente identificado em células de câncer de próstata de rato induzidas a apoptose e codifica uma proteína de 342 aminoácidos que é efetiva na indução de apoptose nas células tumorais e causa regressão dos tumores ativando Fas/FasL e inibindo a atividade de NF-B. O aumento de Par-4 é suficiente para causar apoptose seletiva em células tumorais, mas não em células normais ou imortalizadas. Recentemente, um estudo de nosso grupo demonstrou que a expressão reduzida de Par-4 está associada a um pior prognóstico em câncer de mama e que esta proteína pode ter um papel importante na morfogênese da glândula mamária. O estudo funcional do gene Par-4 em diferentes linhagens de mama é importante para o melhor entendimento do papel deste gene no processo tumorigênico da glândula mamária. Portanto, a proposta do presente estudo foi investigar os efeitos do aumento de expressão ou supressão de Par-4 na proliferação celular e sobrevivência das células normais e tumorais de mama. As células MCF10A e MCF-7 foram transfectadas com os vetores de expressão para Par-4 (pCMV6-PAR-4) ou com oligos siRNA para supressão transiente de Par-4. A caracterização dos clones foi feita por Real Time PCR e Western Blot. Os ensaios de proliferação foram feitos por MTT e os ensaios de apoptose por dupla marcação com Laranja de Acridina/ Hoechst 33342 e por citometria de fluxo. O aumento da expressão de Par-4 diminuiu a proliferação de ambas às células comparadas às células-controle (p<0,01). Por outro lado, a diminuição de expressão de Par-4 por siRNA levou ao aumento da proliferação das células tumorais MCF-7 (p<0,01)...

ABSTRACT

Breast cancer is the most common tumor among women in the world. As for other malignancies the tumorigenic process of the breast involves genetic alterations that drive the progressive transformation of normal cells into malignant cells with and aggressive phenotype. Alterations in cells that upregulate proliferation or downregulate apoptosis are one of essential mechanisms that dictate tumor growth. The PAWR gene, also known as PAR-4 (Prostatic apoptosis response-4), was first identified in prostate cancer cells undergoing apoptosis and encodes a 332 aminoacid protein that is effective in inducing cancer cell apoptosis and cause regression of tumors by activating Fas/FasL and inhibiting NF-B activity. Interestingly, Par-4 overexpression is sufficient to cause apoptosis in cancer cells, but not in normal or immortalized cells. Recently, we demonstrated that reduced expression of PAR-4 is associated with breast cancer poor prognosis and this protein may have a role in the process of the mammary gland morphogenesis. The functional study of Par-4 gene in different cell lines of breast is important to better understand its role in the tumorigenic process of the breast. Therefore, the purpose of the present study was to investigate the effects of overexpression and suppression of PAR-4 in cell proliferation and survival in mammary epithelial cells. MCF10A and MCF-7 cells were transfected with expression vectors for PAR-4 overexpression (pCMV6-PAR-4) or with small interfering RNAs duplexed oligonucleotides. Clone characterization was performed using real time PCR and western blot. Proliferation assays were carried out using MTT and apoptotic assays were performed by doublefluorescence staining technique (Acridine Orange/Hoechst 33342) or using flow cytometry. PAR-4 overexpression decreased the proliferation rates in both MCF10A and MCF-7 cells compared to the parental or control cells (p<0,01)...