Evaluación de la prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en la detección e identificación de Listeria monocytogenes en queso fresco proveniente del Área Metropolitana de San José, Costa Rica / Evaluation of the polymerase chain reaction (PCR) for the detection and identification of Listeria monocytogens in fresh cheese coming from the Metropolitan Area of San José, Costa Rica

RESUMEN

Las enfermedades de origen alimentario son muy importantes a nivel mundial y su frecuencia es persistentemente alta a pesar de diversos esfuerzos enfocados en disminuir su morbilidad y mortalidad. Listeria monocytogenes es uno de los agentes causantes de este tipo de enfermedad. Dentro de la industria láctea, esta bacteria es de especial importancia, ya que, tanto la leche cruda como derivados han sido involucrados en brotes, siendo el queso fresco un alimento especialmente vulnerable a la contaminación con esta bacteria. La identificación tradicional de este género es lenta, laboriosa y poco sensible. El método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) podría permitir el obtener resultados precisos y exactos en menor tiempo, razón por la que el objetivo de este estudio fue el optimizar un procedimiento para la detección de L. monocytogens en queso fresco, así como determinar los límites de sensibilidad, especificidad y valor predictivo de la prueba. Para lograr este objetivo, se evaluaron 76 muestras de queso blanco procesado (45 muestras inoculadas, 31 sin inocular como control negativo). La validación de la técnica fue realizada en 50 muestras de queso fresco no pasteurizado. El aislamiento tradicional de esta bacteria se siguió según la metodología descrita en el Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. La reacción de PCR para la detección de Listeria monocytogenes se basó en la metodología descrita por Poutou usando los iniciadores característicos del género y del gen de la listeriolisina O, específico de especie. Se determinó que el periodo óptimo de incubación para el caldo de enriquecimiento selectivo fue de 48 horas, y se obtuvo un 100% de sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo. La validación de la técnica demostró la especificidad de ésta en cuanto a detectar únicamente la especie L. monocytogenes, no así otras especies que aparecen con relativa frecuencia en matrices y ambientes alimentarios.

ABSTRACT

Food borne diseases are very important worldwide and their frequency is still high despite the different efforts focused in diminishing their morbidity and mortality. Listeria monocytogenes is one of the agents associated in this kind of diseases. In the lactic industry, this bacteria is important since raw milks as well as dairy products have been associated in outbreaks, being fresh cheese one of the most vulnerable products to the contamination with this bacteria. The traditional identification of the bacteria is done by a laborious, time consuming and low sensitive technique and the polymerase chain reaction may allow more precise and exact results in shorter time. For this reason the objective of the present study was to optimize the procedure to determine the sensitivity and specificity limits for the detection of L. monocytogenes from fresh cheese and the predictive value of the test. In order to achieve this objective, 76 pasteurized cheese samples were evaluated (45 samples were artificially inoculated at the lab and 31 were used as negative controls). The validation of the technique was done in 50 samples of non pasteurized fresh cheese. Traditional culture isolation was performed according to the methodology described in Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. PCR reaction for the detection of L. monocytogenes was based on the methodology described by Poutou,using primers characteristic of the genus and the listeriolisine O gene that is specie’s specific. The optimal incubation period determined for the selective enrichment broth was of 48h, and a 100% sensitivity, specificity, predictive value (positive and negative ) were obtained by PCR. The technique validation showed the specificity of the test in the detection of only the L. monocytogenes species, and not other genus or species that may appear in food matrixes or in food environments.