Estudos de peptidases secretadas por Phialophora verrucosa: efeito de inibidores proteolíticos/agentes quelantes na biologia celular / Studies peptidases secreted by Phialophora verrucosa: effects of proteolytic inhibitors / chelating agents in cell biology

RESUMO

Phialophora verrucosa é um dos agentes etiológicos da cromoblastomicose, uma micose que afeta os tecidos cutâneos e subcutâneos. Esta doença é crônica, recidivante e de difícil tratamento. Vários estudos têm demonstrado que peptidases secretadas estão associadas a importantes processos biológicos. Neste trabalho, foi relatada a presença de atividade peptidásica extracelular em P. verrucosa. A peptidase secretada por este fungo apresentou ótima atividade em condições acídicas e à 37ºC. A atividade proteolítica foi completamente inibida por 1,10-Fenantrolina (1,10-Fen) e EGTA, sugerindo a presença de metalopeptidase em P. verrucosa. Zinco (Zn2+) foi o único metal capaz de estimular a atividade peptidásica, de forma dose dependente. Esta atividade enzimática gerou a hidrólise de proteínas do soro e de matriz extracelular como soro albumina humana (HSA), imunoglobulina G (IgG), fibrinogênio, colágeno (tipo I e IV), fibronectina e laminina. Queratina também foi eficientemente hidrolisada pela atividade peptidásica de P. verrucosa. Esses dados sugerem o envolvimento dessa enzima na disseminação fúngica e evasão do sistema imune do hospedeiro. O crescimento de P. verrucosa na presença de 1,10-Fen e seus derivados complexados a metais, como [Cu(fendio)3](ClO4)2•4H2O e [Ag(fendio)2]ClO4 (Fen-Cu2+ e Fen-Ag+, respectivamente) e a forma livre de metal (Fendio) foi também testado. 1,10-Fen foi o composto mais efetivo na inibição da proliferação fúngica. Fen-Cu2+, Fen-Ag+ e Fendio também apresentaram intensa atividade antimicrobiano. O complexo Cu2+ e Fendio foram fungicidas, enquanto Fen-Ag+ demonstrou atividade fungistática. Conídios tratados com 1,10-Fen e seus derivados apresentaram importantes alterações morfológicas, indicativas de morte celular, como determinado por microscopia eletrônica de transmissão. Além disto, Fen-Cu2+ e Fen-Ag+ foram capazes de inibir a atividade proteolítica, enquanto Fendio não afetou a hidrólise do substrato proteico. 1,10-Fen e Fen-Cu2+ inibiram a filamentação de P. verrucosa. No entanto, Fen-Ag+ foi capaz de inibir a produção de esterol por este fungo. Os resultados também sugerem um efeito antifúngico sinérgico entre Fen-Cu2+ e anfotericina B (AMB). Nossos dados suportam a hipótese de que inibidores de metalopeptidases/agentes quelantes apresentam potencial para serem utilizados em modelos futuros para o tratamento da cromoblastomicose.