Padronização da metodologia de Dot-Blot para o diagnóstico rápido da paracoccidioidomicose / Metodology standartization of Dot-Blot for screening of paracoccidioidomycosis

RESUMO

A paracoccidioidomicose (PCM), micose profunda de natureza crônicagranulomatosa, apresenta maior incidência no Brasil. O diagnóstico de certezaderiva da visualização do agente etiológico, o fungo Paracoccidioides spp emamostras biológicas. No entanto, em algumas situações o acesso ao local dalesão impede a coleta do material biológico. Assim, as técnicas imunosorológicaspermitem inferir diagnóstico com certo grau de certeza, otimizandoo tempo utilizado para se obter resultados. A técnica sorológica amplamenteutilizada para o imunodiagnóstico da PCM é a imunodifusão dupla em gel deagarose (ID), com especificidade e sensibilidade variando de 65 a 100%; sendode fácil execução e não necessitando de automação. A técnica de Dot-Blot (DB) tem sido utilizada com sucesso no diagnóstico de inúmeras doençasparasitárias e infecciosas, como a toxoplasmose e a leishmaniose visceral. Nodiagnóstico da PCM, a metodologia mostrou-se promissora noacompanhamento de pacientes durante o tratamento anti-fúngico e eminquéritos soroepidemiológicos. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foipadronizar o ensaio de Dot-Blot visando o diagnóstico rápido da PCM,propondo que o mesmo seja uma ferramenta de triagem dos soros comsuspeita clínica para a doença. A padronização da técnica de Dot-Blot apresentou melhores resultados quando se utilizou antígeno obtido de filtradode cultura de P. brasiliensis do isolado B-339 para a sensibilização demembranas de nitrocelulose. As diluições de soro e conjugado foram de 140 e12000, respectivamente, incubando ambos em solução PBS-L 3%. Para apadronização do ensaio de Dot-Blot, 143 amostras de soro foram utilizadas echamadas de grupo controle. Destas, 23 amostras de soro foram de pacientesaparentemente sadios, 77 amostras de soro de pacientes com PCM confirmadae 43 amostras de soros com outras doenças (tuberculose, aspergilose ehistoplasmose)...

ABSTRACT

The paracoccidioidomycosis (PCM) is the greatest mycosis of chronicgranulomatous nature in Brazil. The definitive diagnosis derives from the view ofthe etiologic agent, Paracoccidioides spp in biological samples. However, insome situations, access to the site of injury prevents the collection of biologicalmaterial. Thus, immuno- serological techniques allow inferring diagnosis with adegree of certainty and optimizing time taken to get results. The serologicaltechnique widely used for immunodiagnosis of PCM is double immunodiffusionin agarose gel (DI), with a sensitivity and specificity ranging from 65 to 100%,being easy to perform and not requiring automation. The Dot-blot (DB)technique has been used successfully in the diagnosis of many infectious andparasitic diseases such as visceral leishmaniasis and toxoplasmosis. On thediagnosis of PCM, this methodology showed promise results in monitoringpatients during treatment with anti-fungal and seroepidemiological surveys.Given the above, the objective of this study was to standardize the Dot-blotassay targeting the rapid diagnosis of PCM, suggesting that it is a screeningtool for sera with clinical suspicion for the disease. The standardization of Dot-Blot showed better results when using antigen obtained from culture filtrate of P.brasiliensis isolated from B-339 to sensitize nitrocellulose membranes. Theserum and conjugated dilutions were...