Estudo da diversidade genotípica de Trypanosoma cruzi em pacientes acometidos com a doença de Chagas crônica em uma coorte do Brasil / Study of genotypic diversity of trypanosoma cruzi in patients with chronic chagas disease in a cohort from Brazil

RESUMO

A doença de Chagas constitui um grande problema de saúde pública em diversospaíses da América Latina. Atualmente, estima-se que 6 a 7 milhões de pessoasestejam infectadas e 75 a 90 milhões estejam expostas à doença. O Trypanosomacruzi, seu agente etiológico, é representado por um conjunto de populações quecirculam em hospedeiros mamíferos e insetos vetores, apresentando grandeheterogeneidade de comportamento biológico e variações na sensibilidade a drogase prognóstico da doença. Assim, um grande desafio vem sendo identificarmarcadores genéticos dos isolados capazes de reuni-los em grupos discretos,visando sua caracterização do ponto de vista epidemiológico e de patogenia. Nestetrabalho, utilizamos metodologias baseadas em PCR convencional e PCR emTempo Real (qPCR) para realizar a quantificação da carga parasitária e tipagemmolecular do parasito diretamente de amostras sanguíneas de pacientes portadoresda doença de Chagas crônica. Para isso, foram selecionados 65 pacientes comsorologia positiva para T. cruzi, apresentando ou não a forma cardíaca da doença, e92 indivíduos com sorologia negativa, todos atendidos no ambulatório do InstitutoNacional de Infectologia Evandro Chagas, provenientes de diferentes regiões doBrasil. As amostras foram coletadas antes de qualquer tratamento e codificadas,para a realização de um estudo simples cego. A extração de DNA foi realizada apartir das amostras de sangue preservadas em Guanidina-EDTA, seguida daquantificação da carga parasitária por qPCR, em uma reação em multiplex, com umalvo para o DNA nuclear satélite de T. cruzi e um alvo para o gene da RNAse Phumana, como um controle interno...

ABSTRACT

Chagas disease is a major public health problem in many Latin American countries.Currently, an estimated 6 to 7 million people are infected and 75 million to 90 millionare exposed to the disease. Trypanosoma cruzi, the etiological agent is representedby a set of populations which circulate in mammalian hosts and insect vectors,presenting highly heterogeneous biological behavior as well as changes in drugsensitivity and prognosis of the disease. Thus, a major challenge is to identify geneticmarkers of isolates able to bring them into discrete groups, for their characterizationfrom an epidemiological point of view and pathogenesis. In this study, we usedconventional PCR based methodologies and Real-Time PCR (qPCR) to perform thequantification of parasite load and molecular typing of the parasite directly from bloodsamples of patients with chronic Chagas disease. Therefore, we selected 65 patientswith positive serology for T. cruzi, with cardiac symptons or not, and 92 with negativeserology, all of them were patients from National Institute of Infectology EvandroChagas (INI), from different regions of Brazil. The samples were collected prior to anytreatment and codified for realization of a single-blind study. DNA extraction wastaken from blood samples preserved in Guanidine-EDTA, followed by quantificationof the parasite load by qPCR, in a multiplex reaction, with a target for nuclear satelliteDNA of T. cruzi and a target for human RNAse P gene, as an internal control. Fromthe 157 patients, 64 proved positive by qPCR...