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Cruzia tentaculata é um helminto parasita de marsupiais e possui ampla distribuição geográfica do México à Argentina. O objetivo deste estudo foi analisar a estrutura genética da população desse nematóide ao longo do bioma Mata Atlântica. Espécimes de Cruzia tentaculata foram recuperados de Didelphis aurita, Didelphis albiventris e Philander quica em 9 localidades. Dados morfológicos e morfométricos foram investigados quanto à diversidade fenotípica entre localidades e hosts usando análise discriminante multivariada de componentes principais. As relações filogenéticas de C. tentaculata foram determinadas usando máxima verossimilhança e inferência bayesiana. A estrutura da população foi analisada por índices de fixação, análise de variância, testes de neutralidade D de Tajima e Fs de Fu, testes de Mantel e agrupamento bayesiano análise. Uma diferença morfométrica significativa maior para os machos foi observada entre as localidades. Nas redes de haplogrupos, 2 grupos foram recuperados, separando locais dos norte e do sul/sudeste. A variação morfométrica em C. tentaculata entre diferentes localidades foi compatível com este padrão norte e sudeste/sul, sugerindo adaptação a diferentes condições ecológicas. Análises genéticas populacionais sugeriram um padrão de processos evolutivos impulsionados por refúgios glaciais do Pleistoceno no nordeste e sudeste da Mata Atlântica com base na distribuição da diversidade genética.