Characterization of mutations in severe methylenetetrahydrofolate reductase deficiency reveals an FAD-responsive mutation.

Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) synthesizes 5-methyltetrahydrofolate, a major methyl donor for homocysteine remethylation to methionine. Severe MTHFR deficiency results in marked hyperhomocysteinemia and homocystinuria. Patients display developmental delay and a variety of neurological and vascular symptoms. Cloning of the human cDNA and gene has enabled the identification of 29 rare mutations in homocystinuric patients and two common variants [677C>T (A222V) and 1298A>C (E429A)] with mild enzymatic deficiency. Homozygosity for 677C>T or combined heterozygosity for both polymorphisms is associated with mild hyperhomocysteinemia. In this communication, we describe four novel mutations in patients with homocystinuria: two missense mutations (471C>G, I153M; 1025T>C, M338T), a nonsense mutation (1274G>A, W421X), and a 2-bp deletion (1553delAG). We expressed the 1025T>C mutation as well as two previously reported amino acid substitutions [983A>G (N324S) and 1027T>G (W339G)] and observed decreased enzyme activity at 10%, 36%, and 21% of control levels, respectively, with little or no effect on affinity for 5-methyltetrahydrofolate. One of these mutations, 983A>G (N324S), showed flavin adenine dinucleotide (FAD) responsiveness in vitro. Expression of these mutations in cis with the 677C>T polymorphism, as observed in the patients, resulted in an additional 50% decrease in enzyme activity. This report brings the total to 33 severe mutations identified in patients with severe MTHFR deficiency.

Transcriptos de fusión del gen BCR/ABL en pacientes con leucemia mieloide crónica / Fusion transcripts of BCR/ABL gene in patients with chronic myeloid leukemia

La anormalidad citogenética más común en la leucemia mieloide crónica (LMC) es el cromosoma Philadelphia, producida por la t(9;22), cuya expresión molecular es el gen de fusión BCR-ABL, que codifica proteínas con actividad tirosinquinasa. Según el punto de ruptura de los genes BCR o ABL se produce una proteína de fusión de 210-kD(p210) o 190-kD(p190). La presencia de este gen de fusión en pacientes con LMC tiene implicancia diagnóstica. Con el propósito de detectar transcriptos de fusión del gen BCR/ABL en pacientes con leucemia mieloide crónica, procedentes de la IX Región de Chile, se estudiaron 14 muestras de sangre de 11 pacientes con LMC. A 2 de ellos, se les realizó seguimiento durante su tratamiento con Gleevec. Se aplicó la técnica de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa (RT-PCR), usando una PCR en nido. Para la detección de los transcriptos de fusión p210 y p190 del gen BCR/ABL, se utilizaron 4 pares de iniciadores. En 9/14 muestras se detectó el transcripto de fusión p210 y en 5/14 los transcriptos de fusión p210 y p190. En los 2 pacientes en seguimiento, hubo desaparición del transcripto p190, permaneciendo el transcripto p210. Estos resultados reafirman la importancia de detectar transcriptos de fusión BCR/ABL para el diagnóstico y seguimiento durante el tratamiento de la LMC.

Multiple transcription start sites and alternative splicing in the methylenetetrahydrofolate reductase gene result in two enzyme isoforms.

Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) reduces 5,10-methylenetetrahydrofolate to 5-methyltetrahydrofolate, the major carbon donor in the remethylation of homocysteine to methionine. Mild MTHFR deficiency, due to a common variant at nucleotide 677, has been reported to alter risk for several disorders including cardiovascular disease, neural tube defects, pregnancy complications, and certain cancers. Little is known about MTHFR regulation, since the complete cDNA and gene sequences have not been determined. In earlier work, we isolated and expressed a 2.2-kb human cDNA comprised of 11 coding exons, and we demonstrated that it encoded an active 70-kDa isoform. However, transcript sizes of approximately 7.5 kb and 9.5 kb and the presence of a second isoform of 77 kDa on Western blots suggested that cDNA sequences were incomplete. In this report, we characterized the complete cDNA and gene structure in human and mouse. Variable 5? and 3? UTR regions were identified, resulting in transcript heterogeneity. The 5? and 3? termini of the MTHFR cDNA were found to overlap with the 5? terminus of a chloride ion channel gene (CLCN-6) and the 3? terminus of an unidentified gene, respectively; this finding has resulted in finer mapping of MTHFR on Chromosome (Chr) 1p36.3. Ribonuclease protection assays identified clusters of transcriptional start sites, suggesting the existence of multiple promoters. MTHFR has several polyadenylation sites creating 3?UTR lengths of 0.2 kb-5.0 kb or 0.6 kb-4.0 kb in human and mouse, respectively. In both species, the previously reported exon 1 was redefined to approximately 3.0 kb in length and shown to be alternatively spliced. An important splice variant contains novel coding sequences; this cDNA was expressed and shown to encode the isozyme of 77 kDa. Our results, which suggest intricate regulation of MTHFR, will facilitate additional regulatory and functional studies of the different isoforms.

[Detection of BCR-ABL gene sequences using RT-PCR in patients with leukemia in the IX region. Chile]. / Detección de secuencias del gen BCR-ABL mediante RT-PCR en pacientes con leucemia en la IX región. Chile.

BACKGROUND: The BCR-ABL fusion gene is the molecular expression of the Philadelphia chromosome. This cytogenetic aberration is the most frequent alteration found in leukemias, which is produced by the translocation t(9;22). Two different fusion proteins are produced depending on the break point (210 kD and 190 kD). The detection of this gene has both diagnostic and prognostic importance, associated with poor prognosis in acute lymphoblastic leukemia (ALL). AIM: To detect BCR-ABL gene sequences in patients with leukemia from the IX Region of Chile. MATERIAL AND METHODS: We studied 58 patients: 5 chronic myeloid leukemia (CML), 35 ALL, 15 acute myeloid leukemia (AML) and 3 biphenotypic leukemia. The gene sequences were detected using reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). RESULTS: BRC-ABL gene sequences were positive in all patients with CML, 2 of 35 ALL (one child and one adult). The remaining patients were negative. We found p210 and p190 co-expression in 2 CML and 1 ALL. CONCLUSIONS: Our results are in agreement with other reports. The detection of these and other genetic alterations will allow us to have invaluable diagnostic and prognostic information from our patients with leukemia.

Evaluación de las constantes hematológicas determinadas por un autoanalizador / Evaluation of the hematological constants determined by self-analyzer

Las constantes hematológicas determinadas por métodos manuales han sido por muchos años un buen índice para estimar la normalidad o patología de las células rojas sanguíneas y según sus valores se han clasificado morfológicamente las anemias. El uso de los autoanalizadores hematológicos ha permitido aumentar la precisión de los parámetros de un hemograma, sin embargo, de las tres constantes determinadas, sólo el volumen corpuscular medio (VCM) es medido directamente, en cambio la hemoglobina corpuscular media (HCM) y la concentración de hemoglobina corpuscular media (CHCM) son calculadas por el instrumento. Nuestro propósito fue evaluar la utilidad de las constantes hematológicas determinadas por un autoanalizador, asociándolas con las características morfológicas de los eritrocitos. Se analizaron 1000 hemogramas realizados en un autoanalizador Cell-Dyn 1400 (Abbott), de pacientes que acuden al consultorio Miraflores en un período de dos meses. En cada caso se observaron las características de los hematíes al frotis. El análisis estadístico se efectuó mediante pruebas t Student, análisis de varianza, comparaciones múltiples de Bonferroni, prueba de Chi2 y regresión logística como modelo predictivo para la determinación de sensibilidad, especificidad y valores predictivos. Los resultados mostraron que el 83 por ciento de los casos con VCM normal presentó normocitosis y el 17 por ciento microcitosis. De los casos con HCM normal, el 97,5 por ciento se asoció con normocromía y el 2,5 por ciento presentó hipocromía. Respecto a la CHCM normal, el 79 por ciento presentó normocromía y en el 21 por ciento se observó hipocromía. Al calcular la sensibilidad y especificidad de las constantes se obtuvo para el VCM: 86,8 por ciento y 87,8 por ciento, para la HCM: 97,5 por ciento y 74,7 por ciento, para la CHCM: 21,5 por ciento y 99 por ciento respectivamente. Se concluye que, de las constantes hematológicas evaluadas, la CHCM no se presenta como una medida válida, ya que en un alto porcentaje de los pacientes con hipocromía al frotis, el autoanalizador entregó un CHCM normal (78 por ciento de falsos negativos), por el contrario, la HCM presentó una alta sensibilidad y un buen rendimiento en la predicción de la hipocromía al frotis (2,5 por ciento de falsos negativos)

Caracterización de 11 anticuerpos monoclonales anti factor von Willebrand / Characterization of 11 anti von Willebrand factor monoclonal antibodies

Se produjeron y caracterizaron 11 anticuerpos monoclonales de hibridomas murinos anti factor von Willebrand humano. Todos mostraron afinidad específica por el factor von Willebrand humano y pertenecen a los isotipos IgG1, IgG2a e IgG2b. Se estudió el efecto de los anticuerpos sobre la actividad Cofactor Ristocetina, encontrándose que 4 de ellos produjeron inhibición parcial

Utilidad de las esterasas combinadas en la diferenciación de las leucemias agudas no linfoblásticas / Usefulness of combined esterases in the differentiation of acute nonlymphoblastic leukemias

En este trabajo se proponen algunas modificaciones al método combinado para esterasas específicas y no específicas (alfa - naftil acetato y cloroacetato), descrito originalmente por Yam et al, para una mejor identificación y diferenciación de los subtipos de las leucemias agudas no linfoblásticas (LANL). De 54 estudios citoquímicos realizados a pacientes con diagnóstico probable de leucemia aguda, 25 reaccionaron positivamente a las esterasas, los cuales según la clasificación FAB, correspondieron a LAM2, LAM4, LAM5 y a Síndromes Mielodisplásticos