ABSTRACT
O enfoque do presente trabalho foi o isolamento e a caracterização de dois genes codificadores de cisteína proteinases de formas amastigotas de L. (L.) amazonensis, LIacys1 e Llacys2. O gene Llacys1 foi obtido pela amplificação por PCR, utilizando-se oligonucleotídeos derivados da região codificadora do gene Lpcys1 de Leishmania (L.) pifanoi e DNA genômico de L. (L.) amazonenses, originando um fragmento de 1.08 kb. O gene Llacys1 foi clonado e seqüenciado e a análise da sua seqüência mostrou que ele apresenta alta identidade com genes codificadores de cisteína proteinases de várias espécies de Leishmania, tais como Lpcys1 de L. (L.) pifanoi, Lmcpa de L. (L.) mexicana, cpa de L. (L.) major e Ldccys2 de L. (L.) chagasi. A análise da seqüência predita de aminoácidos mostrou que a proteinase codificada pelo Llacys1 apresenta a pré e a pró-região, assim como os resíduos conservados de cisteína e histidina presentes no sítio catalítico dessas enzimas e os motivos conservados característicos de cisteína proteinases do tipo catepsina L. Foram também observados nessa seqüência alguns prováveis epítopos de classe I e II do MHC. Dois clones foram isolados de uma genoteca de cDNA de amastigotas de L. (L.) amazonensis previamente construída em vetor ÂZipLox, 2A1 e 3A, que apresentaram 100 por cento de identidade com o gene Llacys1, porém diferiam entre si em relação ao número de tratos de pirimidina presentes nas suas regiões 3'UTR. A expressão do gene Llacys1 em sistema bacteriano só foi possível após a eliminação do seu peptídeo sinal, utilizando a amplificação por PCR a partir da segunda metionina e resultando um fragmento de 870 pb denominado Llacys1'. A expressão do Llacys1' em E. coli gerou uma proteína recombinante que não foi reconhecida pelo AcMo 2E5D3, reativo com a cisteína proteinase de 30 kDa, p30, de L. (L.) amazonensis, indicando que o gene Llacys1 codifica uma cisteína proteinase diferente da p30. O gene Llacys2 de L. (L.) amazonensis foi isolado da...(au)
