ABSTRACT
Several diseases have affected apple production, among them there is Glomerella leaf spot (GLS) caused by Colletotrichum spp. The first report of this disease in apple was in plants nearby citrus orchards in São Paulo State, Brazil. The origin of this disease is still not clear, and studies based on the molecular phylogeny could relate the organisms evolutionarily and characterize possible mechanisms of divergent evolution. The amplification of 5.8S-ITS (Internal Transcribed Spacer) of rDNA of 51 pathogenic Colletotrichum spp. isolates from apples, pineapple guava and citrus produced one fragment of approximately 600 bases pairs (bp) for all the isolates analyzed. The amplified fragments were cleaved with restriction enzymes, and fragments from 90 to 500bp were obtained. The sequencing of this region allowed the generation of a phylogenetic tree, regardless of their hosts, and 5 isolated groups were obtained. From the "in silico" comparison, it was possible to verify a variation from 93 to 100% of similarity between the sequences studied and the Genbank data base. The causal agent of GLS is nearly related (clustered) to isolates of pineapple guava and to the citrus isolates used as control.
A produção de maçã vem sendo comprometida pela ocorrência de muitas doenças, entre as quais se destaca a Mancha Foliar de Glomerella (MFG), causada por Colletotrichum spp. O primeiro relato dessa doença em maçã foi registrado em plantas próximas a pomares de citrus no Estado de São Paulo, Brasil. A origem da MFG ainda não está bem clara, e estudos baseados na filogenia permitirão relacionar o organismo evolutivamente, possibilitando caracterizar possíveis mecanismos divergentes de evolução. A amplificação da região 5.8S-ITS (espaçador interno transcrito) do rDNA de 51 isolados de Colletotrichum patogênicos em de maçã, goiabeira serrana e citrus produziu um fragmento de aproximadamente 600 pares de bases (pb) para todos os isolados analisados. Os fragmentos amplificados foram digeridos por enzimas de restrição, sendo obtidos fragmentos de 90 a 500pb. O sequenciamento dessa região permitiu a construção de uma árvore filogenética com a distribuição dos isolados em cinco grupos, independentemente de seus hospedeiros. A partir da comparação in silico, foi possível verificar uma variação de 93 a 100% de similaridade entre as sequências estudadas e o banco de dados do GenBank. O agente causal da MFG está relacionado (agrupado) a isolados de goiabeira serrana e aos isolados padrões de citrus.
ABSTRACT
Several diseases have affected apple production, among them there is Glomerella leaf spot (GLS) caused by Colletotrichum spp. The first report of this disease in apple was in plants nearby citrus orchards in São Paulo State, Brazil. The origin of this disease is still not clear, and studies based on the molecular phylogeny could relate the organisms evolutionarily and characterize possible mechanisms of divergent evolution. The amplification of 5.8S-ITS (Internal Transcribed Spacer) of rDNA of 51 pathogenic Colletotrichum spp. isolates from apples, pineapple guava and citrus produced one fragment of approximately 600 bases pairs (bp) for all the isolates analyzed. The amplified fragments were cleaved with restriction enzymes, and fragments from 90 to 500bp were obtained. The sequencing of this region allowed the generation of a phylogenetic tree, regardless of their hosts, and 5 isolated groups were obtained. From the "in silico" comparison, it was possible to verify a variation from 93 to 100% of similarity between the sequences studied and the Genbank data base. The causal agent of GLS is nearly related (clustered) to isolates of pineapple guava and to the citrus isolates used as control.
A produção de maçã vem sendo comprometida pela ocorrência de muitas doenças, entre as quais se destaca a Mancha Foliar de Glomerella (MFG), causada por Colletotrichum spp. O primeiro relato dessa doença em maçã foi registrado em plantas próximas a pomares de citrus no Estado de São Paulo, Brasil. A origem da MFG ainda não está bem clara, e estudos baseados na filogenia permitirão relacionar o organismo evolutivamente, possibilitando caracterizar possíveis mecanismos divergentes de evolução. A amplificação da região 5.8S-ITS (espaçador interno transcrito) do rDNA de 51 isolados de Colletotrichum patogênicos em de maçã, goiabeira serrana e citrus produziu um fragmento de aproximadamente 600 pares de bases (pb) para todos os isolados analisados. Os fragmentos amplificados foram digeridos por enzimas de restrição, sendo obtidos fragmentos de 90 a 500pb. O sequenciamento dessa região permitiu a construção de uma árvore filogenética com a distribuição dos isolados em cinco grupos, independentemente de seus hospedeiros. A partir da comparação in silico, foi possível verificar uma variação de 93 a 100% de similaridade entre as sequências estudadas e o banco de dados do GenBank. O agente causal da MFG está relacionado (agrupado) a isolados de goiabeira serrana e aos isolados padrões de citrus.
ABSTRACT
Several diseases have affected apple production, among them there is Glomerella leaf spot (GLS) caused by Colletotrichum spp. The first report of this disease in apple was in plants nearby citrus orchards in São Paulo State, Brazil. The origin of this disease is still not clear, and studies based on the molecular phylogeny could relate the organisms evolutionarily and characterize possible mechanisms of divergent evolution. The amplification of 5.8S-ITS (Internal Transcribed Spacer) of rDNA of 51 pathogenic Colletotrichum spp. isolates from apples, pineapple guava and citrus produced one fragment of approximately 600 bases pairs (bp) for all the isolates analyzed. The amplified fragments were cleaved with restriction enzymes, and fragments from 90 to 500bp were obtained. The sequencing of this region allowed the generation of a phylogenetic tree, regardless of their hosts, and 5 isolated groups were obtained. From the "in silico" comparison, it was possible to verify a variation from 93 to 100% of similarity between the sequences studied and the Genbank data base. The causal agent of GLS is nearly related (clustered) to isolates of pineapple guava and to the citrus isolates used as control.
A produção de maçã vem sendo comprometida pela ocorrência de muitas doenças, entre as quais se destaca a Mancha Foliar de Glomerella (MFG), causada por Colletotrichum spp. O primeiro relato dessa doença em maçã foi registrado em plantas próximas a pomares de citrus no Estado de São Paulo, Brasil. A origem da MFG ainda não está bem clara, e estudos baseados na filogenia permitirão relacionar o organismo evolutivamente, possibilitando caracterizar possíveis mecanismos divergentes de evolução. A amplificação da região 5.8S-ITS (espaçador interno transcrito) do rDNA de 51 isolados de Colletotrichum patogênicos em de maçã, goiabeira serrana e citrus produziu um fragmento de aproximadamente 600 pares de bases (pb) para todos os isolados analisados. Os fragmentos amplificados foram digeridos por enzimas de restrição, sendo obtidos fragmentos de 90 a 500pb. O sequenciamento dessa região permitiu a construção de uma árvore filogenética com a distribuição dos isolados em cinco grupos, independentemente de seus hospedeiros. A partir da comparação in silico, foi possível verificar uma variação de 93 a 100% de similaridade entre as sequências estudadas e o banco de dados do GenBank. O agente causal da MFG está relacionado (agrupado) a isolados de goiabeira serrana e aos isolados padrões de citrus.
ABSTRACT
The genus Colletotrichum is one of the most important pathogenic fungi group, mainly in tropical and subtropical areas of the world. The identification of Colletotrichum species is difficult due to their large morphological variation. Molecular methods, such as PCR-RFLP and rDNA sequence, have been very useful for phylogenic studies of this pathogen. The objective of this work was to compare the PCRRFLP and rDNA sequence techniques for phylogenetic analysis of Colletotrichum spp. Isolates. All isolates were cultivated from cultures grown on Potato Sucrose Broth (PSB), for one week at 24oC. The amplification of the rDNA was accomplished by the ITS1 and ITS4 initiators, followed by digestion of the ITS area using restriction enzymes (Rsa I, Alu I, Hinf I, Hpa II, Hha I, Xho I, Acc I, Eco RI and Taq I). The revelation was made in agarose gel 2%. The primers produced fragments from 600 to 90 pb. The amplified fragment was purified with the kit QIAquick Gel Extraction Kit 250 (Unisciense of Brazil) and the internal transcribed spacer region of the rDNA (ITS1-ITS2) was sequenced. The ITS1- 5.8S-ITS2 sequences were aligned with the software ClustalW and the phylogenetic tree was constructed using the software Mega 3.1. The products obtained with the amplification of the ITS-rDNA produced a fragment of approximately 600 pb, for all the isolated analyzed. The PCR-RFLP technique is not v
O gênero Colletotrichum é dos grupos fitopatogênicos mais importantes, principalmente em regiões tropicais e subtropicais do mundo. A identificação das suas espécies é difícil, devido à grande variação morfológica intraespecífica. Métodos moleculares, como PCR-RFLP e o sequenciamento, têm ganhado destaque em estudos de filogenia deste fitopatógeno. Este trabalho objetivou comparar as técnicas de PCR-RFLP e sequenciamento para análise filogenética entre isolados de Colletotrichum spp. Todos os isolados foram cultivados em meio Batata-Sacarose (BS), por uma semana a 24 oC. Inicialmente foi realizada a amplificação do rDNA, utilizando-se iniciadores ITS1 e ITS4. A seguir foi feita a digestão da região ITS utilizando enzimas de restrição (Rsa I, Alu I, Hinf I, Hpa II, Hha I, Xho I, Acc I, Eco RI e Taq I) e revelação em gel de agarose 2%. Obteve-se uma grande variação com produtos da clivagem, de 500 a 90 pb. Os fragmentos amplificados foram purificados com o kit QIAquick Gel Extraction Kit 250 e as amostras foram sequenciadas na região ITS do rDNA de todos os isolados. As sequências foram alinhadas no software ClustalW e a árvore filogenética foi construída no software Mega 3.1. Os produtos obtidos na amplificação da região ITS1- 5.8S-ITS2 do rDNA, com a utilização do par de iniciadores ITS1 e ITS4, revelaram um fragmento de aproximadamente 600 pb para todos os isolados analisados.
ABSTRACT
The genus Colletotrichum is one of the most important pathogenic fungi group, mainly in tropical and subtropical areas of the world. The identification of Colletotrichum species is difficult due to their large morphological variation. Molecular methods, such as PCR-RFLP and rDNA sequence, have been very useful for phylogenic studies of this pathogen. The objective of this work was to compare the PCRRFLP and rDNA sequence techniques for phylogenetic analysis of Colletotrichum spp. Isolates. All isolates were cultivated from cultures grown on Potato Sucrose Broth (PSB), for one week at 24oC. The amplification of the rDNA was accomplished by the ITS1 and ITS4 initiators, followed by digestion of the ITS area using restriction enzymes (Rsa I, Alu I, Hinf I, Hpa II, Hha I, Xho I, Acc I, Eco RI and Taq I). The revelation was made in agarose gel 2%. The primers produced fragments from 600 to 90 pb. The amplified fragment was purified with the kit QIAquick Gel Extraction Kit 250 (Unisciense of Brazil) and the internal transcribed spacer region of the rDNA (ITS1-ITS2) was sequenced. The ITS1- 5.8S-ITS2 sequences were aligned with the software ClustalW and the phylogenetic tree was constructed using the software Mega 3.1. The products obtained with the amplification of the ITS-rDNA produced a fragment of approximately 600 pb, for all the isolated analyzed. The PCR-RFLP technique is not v
O gênero Colletotrichum é dos grupos fitopatogênicos mais importantes, principalmente em regiões tropicais e subtropicais do mundo. A identificação das suas espécies é difícil, devido à grande variação morfológica intraespecífica. Métodos moleculares, como PCR-RFLP e o sequenciamento, têm ganhado destaque em estudos de filogenia deste fitopatógeno. Este trabalho objetivou comparar as técnicas de PCR-RFLP e sequenciamento para análise filogenética entre isolados de Colletotrichum spp. Todos os isolados foram cultivados em meio Batata-Sacarose (BS), por uma semana a 24 oC. Inicialmente foi realizada a amplificação do rDNA, utilizando-se iniciadores ITS1 e ITS4. A seguir foi feita a digestão da região ITS utilizando enzimas de restrição (Rsa I, Alu I, Hinf I, Hpa II, Hha I, Xho I, Acc I, Eco RI e Taq I) e revelação em gel de agarose 2%. Obteve-se uma grande variação com produtos da clivagem, de 500 a 90 pb. Os fragmentos amplificados foram purificados com o kit QIAquick Gel Extraction Kit 250 e as amostras foram sequenciadas na região ITS do rDNA de todos os isolados. As sequências foram alinhadas no software ClustalW e a árvore filogenética foi construída no software Mega 3.1. Os produtos obtidos na amplificação da região ITS1- 5.8S-ITS2 do rDNA, com a utilização do par de iniciadores ITS1 e ITS4, revelaram um fragmento de aproximadamente 600 pb para todos os isolados analisados.