ABSTRACT
Changes in promoter structure and occupation have been shown to modify the splicing pattern of several genes, evidencing a coupling between transcription and alternative splicing. It has been proposed that the promoter effect involves modulation of RNA pol II elongation rates. The C4 point mutation of the Drosophila pol II largest subunit confers on the enzyme a lower elongation rate. Here we show that expression of a human equivalent to Drosophila's C4 pol II in human cultured cells affects alternative splicing of the fibronectin EDI exon and adenovirus E1a pre-mRNA. Most importantly, resplicing of the Hox gene Ultrabithorax is stimulated in Drosophila embryos mutant for C4, which demonstrates the transcriptional control of alternative splicing on an endogenous gene. These results provide a direct proof for the elongation control of alternative splicing in vivo.
Subject(s)
Alternative Splicing , RNA Polymerase II/chemistry , RNA Polymerase II/metabolism , Adenoviridae/genetics , Adenovirus E1A Proteins/genetics , Amanitins/pharmacology , Animals , Cell Line, Tumor , Dose-Response Relationship, Drug , Drosophila Proteins/genetics , Drosophila melanogaster , Exons , Fibronectins/metabolism , Homeodomain Proteins/genetics , Humans , Models, Biological , Models, Genetic , Plasmids/metabolism , Point Mutation , Promoter Regions, Genetic , Protein Isoforms , RNA/metabolism , RNA, Messenger/metabolism , Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction , Ribonucleases/metabolism , Time Factors , Transcription Factors/genetics , TransfectionABSTRACT
The realization that the mammalian proteomic complexity is achieved with a limited number of genes demands a better understanding of alternative splicing regulation. Promoter control of alternative splicing was originally described by our group in studies performed on the fibronectin gene. Recently, other labs extended our findings to the cystic fibrosis, CD44 and CGRP genes strongly supporting a coupling between transcription and pre-mRNA splicing. A possible mechanism that would fit in these results is that the promoter itself is responsible for recruiting splicing factors, such as SR proteins, to the site of transcription, possibly through transcription factors that bind the promoter or the transcriptional enhancers. An alternative model, discussed more extensively in this review, involves modulation of RNA pol II (pol II) elongation rate. The model is supported by findings that cis- and trans- acting factors that modulate pol II elongation on a particular template also provoke changes in the alternative splicing balance of the encoded mRNAs.
Subject(s)
Alternative Splicing , RNA Polymerase II/metabolism , RNA Precursors/metabolism , RNA, Messenger/metabolism , Animals , Models, Genetic , RNA-Binding Proteins/metabolism , Transcription, GeneticABSTRACT
Promoter and enhancer elements can influence alternative splicing, but the basis for this phenomenon is not well understood. Here we investigated how different transcriptional activators affect the decision between inclusion and exclusion (skipping) of the fibronectin EDI exon. A mutant of the acidic VP16 activation domain called SW6 that preferentially inhibits polymerase II (pol II) elongation caused a reduction in EDI exon skipping. Exon skipping was fully restored in the presence of the SW6 mutant by either the SV40 enhancer in cis or the human immunodeficiency virus (HIV) Tat in trans, both of which specifically stimulate pol II elongation. HIV Tat also cooperated with the Sp1 and CTF activation domains to enhance transcript elongation and EDI skipping. The extent of exon skipping correlated with the efficiency with which pol II transcripts reach the 3' end of the gene but not with the overall fold increase in transcript levels caused by different activators. The ability of activators to enhance elongation by RNA polymerase II therefore correlates with their ability to enhance exon skipping. Consistent with this observation, the elongation inhibitor dichlororibofuranosylbenzimidazole (DRB) enhanced EDI inclusion. Conversely, the histone deacetylase inhibitor trichostatin A that is thought to stimulate elongation caused a modest inhibition of EDI inclusion. Together our results support a kinetic coupling model in which the rate of transcript elongation determines the outcome of two competing splicing reactions that occur co-transcriptionally. Rapid, highly processive transcription favors EDI exon skipping, whereas slower, less processive transcription favors inclusion.
Subject(s)
Alternative Splicing , Fibronectins/genetics , Simian virus 40/genetics , Trans-Activators/metabolism , Transcription, Genetic , Animals , Antigens, Polyomavirus Transforming/genetics , COS Cells , Chlorocebus aethiops , Enhancer Elements, Genetic , Exons , Gene Expression Regulation, Viral/physiology , RNA Polymerase II/genetics , Replication Origin , TransfectionABSTRACT
En el presente estudio, se analizó la posibilidad de que las distintas formas de fibronectina (FN), producidas como resultado de la maduración alternativa (alternative splicing) del mensajero, ejerzan funciones diferenciales en el desarrollo folicular. En particular se determinó la presencia de la región ED-I, ausente en la FN plasmática, tanto a nivel de mensajero como de proteína, durante este proceso. El análisis de los niveles de FN en fluidos foliculares correspondientes a distintas etapas de desarrollo mostró marcadas variaciones en la concentración de FN ED-I+ y los de permanecieron relativamente constantes. En folículos corespondientes a la fase de selección se observó una correlación inversa entre los niveles de FN ED-I+ y los de estradio (p<0.001). El tratamiento con estradiol no tuvo efecto sobre el splicing alternativo de FN en cultivos de células de la granulosa bovinas, mientras que el AMPc tuvo un efecto inhibitorio sobre la incorporación de ED-I. Por otra parte, el factor de crecimiento transformante tipo beta (TGF-beta) estimuló tanto la produción de FN total como la inclusión de la región ED-I. Este efecto fue verificado tanto a nivel de la proteína (Western blots) como del ARN mensajero (Northern blots). Un péptido correspondiente a la región ED-I tuvo un efecto estimulatorio sobre el crecimento de una línea de células de la granulosa bovinas (BGC-1) mientras que el péptido correspondiente e las regiones flanqueantes no tuvo efecto. Los datos presentados en este estudio plantean una nueva forma de regulación mediante la cual cambios cualitativos en la estructura primaria de la FN podrían mediar algunas de las acciones de gonadotrofinas y factores intraováricos durante el desarrollo folicular. (AU)
Subject(s)
In Vitro Techniques , Animals , Follicular Fluid/chemistry , Fibronectins/physiology , Fibronectins/analysis , Ovarian Follicle/growth & development , Cattle/physiology , Alternative SplicingABSTRACT
En el presente estudio, se analizó la posibilidad de que las distintas formas de fibronectina (FN), producidas como resultado de la maduración alternativa (alternative splicing) del mensajero, ejerzan funciones diferenciales en el desarrollo folicular. En particular se determinó la presencia de la región ED-I, ausente en la FN plasmática, tanto a nivel de mensajero como de proteína, durante este proceso. El análisis de los niveles de FN en fluidos foliculares correspondientes a distintas etapas de desarrollo mostró marcadas variaciones en la concentración de FN ED-I+ y los de permanecieron relativamente constantes. En folículos corespondientes a la fase de selección se observó una correlación inversa entre los niveles de FN ED-I+ y los de estradio (p<0.001). El tratamiento con estradiol no tuvo efecto sobre el splicing alternativo de FN en cultivos de células de la granulosa bovinas, mientras que el AMPc tuvo un efecto inhibitorio sobre la incorporación de ED-I. Por otra parte, el factor de crecimiento transformante tipo beta (TGF-beta) estimuló tanto la produción de FN total como la inclusión de la región ED-I. Este efecto fue verificado tanto a nivel de la proteína (Western blots) como del ARN mensajero (Northern blots). Un péptido correspondiente a la región ED-I tuvo un efecto estimulatorio sobre el crecimento de una línea de células de la granulosa bovinas (BGC-1) mientras que el péptido correspondiente e las regiones flanqueantes no tuvo efecto. Los datos presentados en este estudio plantean una nueva forma de regulación mediante la cual cambios cualitativos en la estructura primaria de la FN podrían mediar algunas de las acciones de gonadotrofinas y factores intraováricos durante el desarrollo folicular.