Bovine herpesvirus 5 detection by virus isolation in cell culture and multiplex-PCR in central nervous system from cattle with neurological disease in Brazilian herds

Bovine herpesvirus 5 (BoHV-5) is an important cause of meningoencephalitis in young and adult cattle. The multiple etiology of neurological disturbances in cattle makes the quick and conclusive diagnosis of BoHV-5 infection important for animal and public health, mainly because of herbivore rabies that is endemic in Brazilian cattle herds. The objective of this retrospective study was to use a multiplex-polymerase chain reaction (multiplex-PCR) for BoHV-5 and BoHV-1 glycoprotein C gene detection from stored central nervous system (CNS) tissue fragments of cattle with neurological clinical signs. Forty-seven frozen CNS samples of young and adult cattle from 31 herds in three Brazilian geographical regions (South, Southeast, and Center-west) were evaluated. Eighteen (38.3%) of these CNS samples were BoHV-positive by virus isolation in cell culture. By multiplex-PCR 30 (63.8%) CNS samples were BoHV-5 positive. All 18 positive samples by virus isolation were confirmed as BoHV-5 by the multiplex-PCR, that provided a increase of 25.5% (12/47) in the BoHV-5 diagnosis rate. BoHV-1 was not detected in any CNS sample. This retrospective study demonstrated the wide regional distribution of BoHV-5 infection in Brazilian cattle herds since positive results were obtained in CNS samples of cattle with neurological disease from Paraná, São Paulo, Minas Gerais, Mato Grosso, and Mato Grosso do Sul States.

O herpesvírus bovino 5 (BoHV-5) é um importante agente etiológico de meningoencefalite em bovinos jovens e adultos. A etiologia múltipla dos distúrbios neurológicos em bovinos torna o diagnóstico conclusivo do BoHV-5 importante tanto em termos de sanidade animal quanto de saúde pública, principalmente pela característica endêmica da raiva dos herbívoros nos rebanhos bovinos brasileiros. O objetivo desse estudo retrospectivo foi utilizar a reação em cadeia da polimerase (multiplex-PCR) para a detecção do gene da glicoproteína C do BoHV-5 e do BoHV-1 em fragmentos estocados de sistema nervoso central (SNC) de bovinos com sinais clínicos neurológicos. Foram avaliadas 47 amostras congeladas de fragmentos de SNC de bovinos jovens e adultos pertencentes a 31 rebanhos de três regiões geográficas brasileiras (Sul, Sudeste e Centro-oeste). Por meio do isolamento viral em cultivo celular foi possível o isolamento do BoHV em 18 (38,3%) amostras. Pela técnica de multiplex-PCR 30 (63,8%) amostras de SNC foram positivas para o BoHV-5. Todas as 18 amostras positivas no isolamento viral foram confirmadas como BoHV-5 pela multiplex-PCR, proporcionando um incremento na taxa de diagnóstico do BoHV-5 de 25,5% (12/47). Em nenhuma das amostras avaliadas foi possível a identificação do BoHV-1 pela multiplex-PCR. Esse estudo retrospectivo demonstrou a ampla distribuição da infecção pelo BoHV-5 nos rebanhos bovinos brasileiros uma vez que resultados positivos foram obtidos em amostras de SNC colhidas de bovinos com doença neurológica, provenientes dos estados do Paraná, São Paulo, Minas Gerais, Mato Grosso e Mato Grosso do Sul.

Standardization of a polymerase chain reaction (Semi NestedPCR) to detect bovine herpesvirus type 1 in aborted fetus and semen from naturally infected cattle / Otimização da reação em cadeia pela polimerase (Semi Nested-PCR) para a detecção do herpesvírus bovino tipo 1 em fragmentos de órgãos fetais e em sêmen de bovinos naturalmente infectados

The glycoprotein D gene of bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) was detected in clinical samples from naturally infected cattle by semi-nested polymerase chain reaction (SN-PCR). Different protocols were tested to increase the sensitivity and specificity of the technique. An association of DNA extraction methods using phenol/chloroform/isoamyl alcohol followed by silica/guanidine isothiocyanate yield greater concentration and quality of amplified DNA. After optimization of primers and reaction conditions, the genome of BHV-1 (Los Angeles strain) was detected by SN-PCR in tissue culture supernatant and artificially infected semen at the 1 and 0.1 TCID50 limit, respectively. When used on clinical specimens from naturally infected cattle, the SN-PCR yield positive results in semen of seropositive bull and in organ fragments of aborted cattle fetus. The SN-PCR was a viable alternative, which was faster, sensitive, specific and less laborious to be used in the routine diagnosis of BHV-1 infection and semen health monitoring.

A reação em cadeia pela polimerase (PCR) foi empregada para a detecção parcial do gene da glicoproteína D do herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1) em material biológico proveniente de bovinos naturalmente infectados. Para o aumento da sensibilidade e da especificidade da PCR, foram avaliados diferentes protocolos. Para a extração do DNA, a associação dos métodos fenol/clorofórmio/álcool isoamílico e sílica/tiocianato de guanidina, proporcionou a amplificação do DNA em maior concentração e qualidade. Após a otimização dos primers e condições da reação foi possível detectar, por meio da Semi Nested-PCR (SN-PCR), o genoma da estirpe Los Angeles do BHV-1 em sobrenadante de cultura celular, sem processamento prévio, até o limite de 1 TCID50. Em sêmen artificialmente infectado o limite de detecção do BHV-1 foi de 0,1 TCID50. Quando utilizada em material biológico, proveniente de bovinos naturalmente infectados, a SN-PCR apresentou resultados positivos tanto em fragmentos de órgãos de fetos bovinos abortados quanto em sêmen. Essa técnica revelou-se uma alternativa viável, rápida, sensível e específica para aplicação na rotina de diagnóstico da infecção pelo BHV-1, bem como, para o monitoramento sanitário do sêmen.

Standardization of a polymerase chain reaction (Semi NestedPCR) to detect bovine herpesvirus type 1 in aborted fetus and semen from naturally infected cattle / Otimização da reação em cadeia pela polimerase (Semi Nested-PCR) para a detecção do herpesvírus bovino tipo 1 em fragmentos de órgãos fetais e em sêmen de bovinos naturalmente infectados

The glycoprotein D gene of bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) was detected in clinical samples from naturally infected cattle by semi-nested polymerase chain reaction (SN-PCR). Different protocols were tested to increase the sensitivity and specificity of the technique. An association of DNA extraction methods using phenol/chloroform/isoamyl alcohol followed by silica/guanidine isothiocyanate yield greater concentration and quality of amplified DNA. After optimization of primers and reaction conditions, the genome of BHV-1 (Los Angeles strain) was detected by SN-PCR in tissue culture supernatant and artificially infected semen at the 1 and 0.1 TCID50 limit, respectively. When used on clinical specimens from naturally infected cattle, the SN-PCR yield positive results in semen of seropositive bull and in organ fragments of aborted cattle fetus. The SN-PCR was a viable alternative, which was faster, sensitive, specific and less laborious to be used in the routine diagnosis of BHV-1 infection and semen health monitoring.

A reação em cadeia pela polimerase (PCR) foi empregada para a detecção parcial do gene da glicoproteína D do herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1) em material biológico proveniente de bovinos naturalmente infectados. Para o aumento da sensibilidade e da especificidade da PCR, foram avaliados diferentes protocolos. Para a extração do DNA, a associação dos métodos fenol/clorofórmio/álcool isoamílico e sílica/tiocianato de guanidina, proporcionou a amplificação do DNA em maior concentração e qualidade. Após a otimização dos primers e condições da reação foi possível detectar, por meio da Semi Nested-PCR (SN-PCR), o genoma da estirpe Los Angeles do BHV-1 em sobrenadante de cultura celular, sem processamento prévio, até o limite de 1 TCID50. Em sêmen artificialmente infectado o limite de detecção do BHV-1 foi de 0,1 TCID50. Quando utilizada em material biológico, proveniente de bovinos naturalmente infectados, a SN-PCR apresentou resultados positivos tanto em fragmentos de órgãos de fetos bovinos abortados quanto em sêmen. Essa técnica revelou-se uma alternativa viável, rápida, sensível e específica para aplicação na rotina de diagnóstico da infecção pelo BHV-1, bem como, para o monitoramento sanitário do sêmen.

Prevalência de anticorpos neutralizantes contra o herpesvírus bovino tipo 1, decorrente de infecção natural, em rebanhos com distúrbios reprodutivos

Serum samples of 1235 adult cattle not infectious bovine rhinotracheitis-vaccinated were analyzed by serum neutralization technique for Bovine Herpesvirus type 1 (BHV-1) antibodies. The samples were collected from 81 beef and dairy herds presenting reproductive problems, at 30 counties of Paraná State, Brazil. In dairy herds 41.9% (409/977) of the serum samples and 90.5% (57/63) of the herds were positives. In beef herds the index of positives was 50.8% (131/258) and 100% (18/18) for serum samples and herds, respectively. The total positive frequency of serum samples (43.7%) and herds (92.6%) show that BHV-1 infections has a wide dissemination in the studied region.

A detecção de anticorpos anti-Herpesvírus Bovino tipo 1 (BHV-1) foi realizada, através da técnica de soroneutralização, em 1235 amostras de soro de bovinos adultos, não-vacinados contra Rinotraqueíte Infecciosa Bovina. As amostras de soro analisadas foram colhidas em 81 rebanhos, com histórico de problemas reprodutivos, incluindo animais com aptidão para carne e leite, provenientes de 30 municípios do Estado do Paraná. Na amostragem proveniente de rebanhos leiteiros, 41,9% (409/977) das amostras de soro e 90,5% (57/63) dos rebanhos foram considerados positivos. Em bovinos de corte, o índice de soropositividade foi de 50,8% (131/258) e 100% (18/18) para amostras de soro e rebanhos, respectivamente. As freqüências de 43,7% (540/1235) de animais e 92,6% (75/81) de rebanhos soropositivos demonstram que as infecções por BHV-1 apresentam-se amplamente disseminadas nas regiões estudadas.

Ensaio imunoenzimático comercial no diagnóstico sorológico das infecções por herpesvírus bovino 1

The performance of a commercial immune assay in the identification antibody of natural infection or vaccination against bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) in 1000 samples of bovine serum was evaluated. The comparative analysis from the result of the evaluated system and standard serum neutralization technique showed a rate of agreement of 97.05% (K=0.94) between the two serologic diagnotic methods.

Avaliou-se o desempenho de um ensaio imunoenzimático, obtido de fonte comercial, na identificação de anticorpos contra herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1), induzidos tanto por infecção natural quanto por vacinação, em 1000 amostras de soros sangüíneos de bovinos. A análise comparativa dos resultados obtidos no sistema avaliado e na técnica padrão de soroneutralização mostrou uma concordância de 97,05% (K=0,94) entre as duas metodologias de diagnóstico sorológico.

Ensaio imunoenzimático comercial no diagnóstico sorológico das infecções por herpesvírus bovino 1

The performance of a commercial immune assay in the identification antibody of natural infection or vaccination against bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) in 1000 samples of bovine serum was evaluated. The comparative analysis from the result of the evaluated system and standard serum neutralization technique showed a rate of agreement of 97.05% (K=0.94) between the two serologic diagnotic methods.

Avaliou-se o desempenho de um ensaio imunoenzimático, obtido de fonte comercial, na identificação de anticorpos contra herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1), induzidos tanto por infecção natural quanto por vacinação, em 1000 amostras de soros sangüíneos de bovinos. A análise comparativa dos resultados obtidos no sistema avaliado e na técnica padrão de soroneutralização mostrou uma concordância de 97,05% (K=0,94) entre as duas metodologias de diagnóstico sorológico.

Prevalência de anticorpos neutralizantes contra o herpesvírus bovino tipo 1, decorrente de infecção natural, em rebanhos com distúrbios reprodutivos

Serum samples of 1235 adult cattle not infectious bovine rhinotracheitis-vaccinated were analyzed by serum neutralization technique for Bovine Herpesvirus type 1 (BHV-1) antibodies. The samples were collected from 81 beef and dairy herds presenting reproductive problems, at 30 counties of Paraná State, Brazil. In dairy herds 41.9% (409/977) of the serum samples and 90.5% (57/63) of the herds were positives. In beef herds the index of positives was 50.8% (131/258) and 100% (18/18) for serum samples and herds, respectively. The total positive frequency of serum samples (43.7%) and herds (92.6%) show that BHV-1 infections has a wide dissemination in the studied region.

A detecção de anticorpos anti-Herpesvírus Bovino tipo 1 (BHV-1) foi realizada, através da técnica de soroneutralização, em 1235 amostras de soro de bovinos adultos, não-vacinados contra Rinotraqueíte Infecciosa Bovina. As amostras de soro analisadas foram colhidas em 81 rebanhos, com histórico de problemas reprodutivos, incluindo animais com aptidão para carne e leite, provenientes de 30 municípios do Estado do Paraná. Na amostragem proveniente de rebanhos leiteiros, 41,9% (409/977) das amostras de soro e 90,5% (57/63) dos rebanhos foram considerados positivos. Em bovinos de corte, o índice de soropositividade foi de 50,8% (131/258) e 100% (18/18) para amostras de soro e rebanhos, respectivamente. As freqüências de 43,7% (540/1235) de animais e 92,6% (75/81) de rebanhos soropositivos demonstram que as infecções por BHV-1 apresentam-se amplamente disseminadas nas regiões estudadas.

Epidemiological aspects of porcine rotavirus in southwest of Parana state, Brazil / Aspectos epidemiológicos da rotavirose suína na região sudoeste do estado do Paraná, Brasil

A longitudinal study was performed during 18 months to obtain epidemiological data from porcine rotaviruses in a flock from Southwest area of Parana State, Brazil. Electropherogroup A of porcine rotavirus (PRV) was identified by polyacrylamide gel electrophoresis in 137 (27.8%) of 492 diarrheic fecal samples. The infection was more common in prior and post weaning periods. Fecal samples from four and five weeks old piglets were positive for PRV respectively in 48.4% and 40.8%, of the cases. The virus was identified through out the year. There was no seasonal distribution, showing the endemic character of the infection. Low relative humidity of the air, high population density and concentration of gilt farrow contributed with an increase in the frequency of infection.

Um estudo longitudinal, realizado por um período de 18 meses, a valiou alguns aspectos epidemiológicos da rotavirose suína em um rebanho da região sudoeste do Estado do Paraná. Através da técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida foi possível a identificação de RNA de fita dupla segmentado do rotavírus suíno (RVS), eletroferogrupo A, em 137 (27,8%) das 492 amostras de fezes diarréicas analisadas. A infecção foi mais freqüente nos períodos imediatamente anterior e posterior ao desmame. Nas amostras de fezes colhidas de leitões com quatro e cinco semanas de idade foi observada uma positividade para o RVS de 48,4% e 40,8%, respectivamente. O RVS foi identificado em todos os 10 lotes de animais avaliados, evidenciando o caráter endêmico desta virose entérica no período e região estudados. Não foi possível caracterizar uma distribuição sazonal da infecção, entretanto alguns aspectos como baixa umidade relativa do ar, alta densidade populacional e a concentração de partos de fêmeas primíparas contribuíram com o aumento na freqüência de diagnóstico do RVS.

Epidemiological aspects of porcine rotavirus in southwest of Parana state, Brazil / Aspectos epidemiológicos da rotavirose suína na região sudoeste do estado do Paraná, Brasil

A longitudinal study was performed during 18 months to obtain epidemiological data from porcine rotaviruses in a flock from Southwest area of Parana State, Brazil. Electropherogroup A of porcine rotavirus (PRV) was identified by polyacrylamide gel electrophoresis in 137 (27.8%) of 492 diarrheic fecal samples. The infection was more common in prior and post weaning periods. Fecal samples from four and five weeks old piglets were positive for PRV respectively in 48.4% and 40.8%, of the cases. The virus was identified through out the year. There was no seasonal distribution, showing the endemic character of the infection. Low relative humidity of the air, high population density and concentration of gilt farrow contributed with an increase in the frequency of infection.  

Um estudo longitudinal, realizado por um período de 18 meses, a valiou alguns aspectos epidemiológicos da rotavirose suína em um rebanho da região sudoeste do Estado do Paraná. Através da técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida foi possível a identificação de RNA de fita dupla segmentado do rotavírus suíno (RVS), eletroferogrupo A, em 137 (27,8%) das 492 amostras de fezes diarréicas analisadas. A infecção foi mais freqüente nos períodos imediatamente anterior e posterior ao desmame. Nas amostras de fezes colhidas de leitões com quatro e cinco semanas de idade foi observada uma positividade para o RVS de 48,4% e 40,8%, respectivamente. O RVS foi identificado em todos os 10 lotes de animais avaliados, evidenciando o caráter endêmico desta virose entérica no período e região estudados. Não foi possível caracterizar uma distribuição sazonal da infecção, entretanto alguns aspectos como baixa umidade relativa do ar, alta densidade populacional e a concentração de partos de fêmeas primíparas contribuíram com o aumento na freqüência de diagnóstico do RVS.    

The effects of Bovine herpesvirus type 1 infection on reproductive system of cattle / Consequências da infecção pelo herpesvirus bovino tipo 1 sobre o sistema reprodutivo de bovinos

Bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) is recognized a major pathogen in young and adults bovines. After the first infection, the viral latency induces the animals of the carrier state and possible transmitters due to its viral reexcretion episodes. This BHV-1 biological characteristics is responsible for the maintenance and expansion of the infections which composes the Infectious bovine rhinotracheitis (IBR) and Infectious pustular vulvovaginitis (IPV) complex. In the dependency, among other factors, of the viral subtype may determine respiratory, reproductive, nervous and systemic signals. Despite of being identified in the 60s in Brazil, only recently BHV-1 infections were diagnosed in a routine, by serologic techniques. In the present cattle raising system, low levels of reproduction on bovine herd may be responsible for impossibility of the production. Therefore, the infections that undertake the reproductive scale assume a vast sanitary importance. This review has as objective to present and make comments on some topics related to etiologic agent, clinic signal symptoms, diagnosis, control and prophylaxis of BHV-1 infection that undertake the breeding reproduction on bovines.  

O Herpesvirus bovino tipo 1 (BHV-1) é reconhecidamente um dos principais patógenos de bovinos jovens e adultos. Após a primo infecção, a latência viral induz nos animais o estado de portadores e potenciais transmissores devido aos episódios de reexcreção viral. Esta característica biológica do BHV-1 é responsável pela manutenção e expansão da infecção nos rebanhos. Clinicamente as infecções que compõem o complexo rinotraqueíte infecciosa bovina (IBR) e vulvovaginite pustular infecciosa (IPV) na dependência, entre outros fatores, do subtipo virai podem ocasionar sinais respiratórios, reprodutivos, nervosos e sistêmicos. Mesmo tendo sido identificado no Brasil já na década de 60, apenas recentemente as infecções pelo BHV-1 passaram a ser rotineiramente diagnosticadas através de técnicas sorológicas. Particularmente nos sistemas de criação mais tecnificados, que exigem maiores custos de produção, baixos índices reprodutivos nos rebanhos bovinos podem ser responsáveis pela inviabilidade da exploração. Com isto, infecções que comprometem a esfera reprodutiva assumem grande importância sanitária. Esta revisão tem como objetivo apresentar e comentar alguns tópicos relativos ao agente etiológico, sinais clínicos, diagnóstico, controle e profilaxia das infecções pelo BHV-1 que apresentam como conseqüências, diretas e/ou indiretas, reduções no desempenho reprodutivo dos bovinos.