Development of a biologically immortalized equine stem cell line.

Bone repair in horses implies invasive surgeries and increased cost. Research on musculoskeletal disorders therapy in horses includes cell-based therapy with mesenchymal stromal cells (MSCs). Mesenchymal stromal cells can be obtained from bone marrow (BMMSCs). Unfortunately, BMMSCs have limited cell replication in vitro. The objective of this study was to develop a biologically immortalized equine stem cell line derived from bone marrow, with unlimited in-vitro proliferation and the ability to differentiate into bone cells. Equine BMMSCs were transfected and immortalized with human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene. Cell passages from equine immortal BMMSCs were characterized by the presence of stemness CD markers and expression of multi-potent differentiation genes (OCT-4, SOX2, and NANOG). Equine immortal BMMSCs were incubated in osteogenic medium and bone cell differentiation was determined by alkaline phosphatase and von Kossa staining, and osteogenic gene expression (osteocalcin, Runx2, and osterix). Telomerase activity was determined by telomeric repeat amplification technique. Results showed that equine immortal BMMSCs were able to replicate in-vitro up to passage 50 and maintain stem cell characteristics by the presence of CD90 and expression of multi-potent genes. Equine immortal BMMSCs were able to differentiate into bone cells, which was confirmed by the positive osteogenic staining and gene expression. Equine BMMSCs were successfully immortalized and maintained characteristics of stem cells and readily differentiated into osteogenic cells. Extending the life span of equine BMMSCs by transfection of the hTERT gene will revolutionize the clinical use of MSCs by making them available to orthopedic surgeons "off the shelf."

La réparation osseuse chez les chevaux implique des chirurgies invasives et des coûts accrus. La recherche sur la thérapie des troubles musculosquelettiques chez les chevaux comprend la thérapie cellulaire avec des cellules stromales mésenchymateuses (CSM). Les CSM peuvent être obtenues à partir de la moelle osseuse (BMMSC). Malheureusement, les BMMSC ont une réplication cellulaire limitée in vitro. L'objectif de cette étude était de développer une lignée de cellules souches équines immortalisées biologiquement dérivées de la moelle osseuse, avec une prolifération in vitro illimitée et la capacité de se différencier en cellules osseuses. Les BMMSC équines ont été transfectées et immortalisées avec le gène de la transcriptase inverse de la télomérase humaine (hTERT). Les passages cellulaires des BMMSC immortels équins ont été caractérisés par la présence de marqueurs CD de souche et l'expression de gènes de différenciation multipotents (OCT-4, SOX2 et NANOG). Des BMMSC équins immortels ont été incubés dans un milieu ostéogénique et la différenciation des cellules osseuses a été déterminée par coloration à la phosphatase alcaline et de von Kossa, et l'expression des gènes ostéogéniques (ostéocalcine, Runx2 et osterix). L'activité de la télomérase a été déterminée par la technique d'amplification répétée des télomères. Les résultats ont montré que les BMMSC équins immortels étaient capables de se répliquer in vitro jusqu'au passage 50 et de maintenir les caractéristiques des cellules souches par la présence de CD90 et l'expression de gènes multipotents. Les BMMSC immortelles équines ont pu se différencier en cellules osseuses, ce qui a été confirmé par la coloration ostéogénique positive et l'expression des gènes. Les BMMSC équines ont été immortalisées avec succès et ont conservé les caractéristiques des cellules souches et facilement différenciées en cellules ostéogéniques. L'extension de la durée de vie des BMMSC équins par transfection du gène hTERT révolutionnera l'utilisation clinique des MSC en les mettant à la disposition des chirurgiens orthopédistes prête à l'emploi.(Traduit par Docteur Serge Messier).

Three Optimized Methods for In Situ Quantification of Progenitor Cell Proliferation in Embryonic Kidneys Using BrdU, EdU, and PCNA.

BACKGROUND: Nephron progenitor cells derived from the metanephric mesenchyme undergo a complex balance of self-renewal and differentiation throughout kidney development to give rise to the mature nephron. Cell proliferation is an important index of progenitor population dynamics. However, accurate and reproducible in situ quantification of cell proliferation within progenitor populations can be technically difficult to achieve due to the complexity and harsh tissue treatment required of certain protocols. OBJECTIVE: To optimize and compare the performance of the 3 most accurate S phase-specific labeling methods used for in situ detection and quantification of nephron progenitor and ureteric bud cell proliferation in the developing kidney, namely, 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU), 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), and proliferating cell nuclear antigen (PCNA). METHODS: Protocols for BrdU, EdU, and PCNA were optimized for fluorescence labeling on paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded mouse kidney tissue sections, with co-labeling of nephron progenitor cells and ureteric bud with Six2 and E-cadherin antibodies, respectively. Image processing and analysis, including quantification of proliferating cells, were carried out using free ImageJ software. RESULTS: All 3 methods detect similar ratios of nephron progenitor and ureteric bud proliferating cells. The BrdU staining protocol is the lengthiest and most complex protocol to perform, requires tissue denaturation, and is most subject to interexperimental signal variability. In contrast, bound PCNA and EdU protocols are relatively more straightforward, consistently yield clear results, and far more easily lend themselves to co-staining; however, the bound PCNA protocol requires substantive additional postexperimental analysis to distinguish the punctate nuclear PCNA staining pattern characteristic of proliferating cells. CONCLUSIONS: All 3 markers exhibit distinct advantages and disadvantages in quantifying cell proliferation in kidney progenitor populations, with EdU and PCNA protocols being favored due to greater technical ease and reproducibility of results associated with these methods.

CONTEXTE: Les cellules progénitrices de néphrons dérivées du mésenchyme métanéphrique subissent une séquence complexe d'auto-régénération et de différenciation tout au long du développement du rein pour donner naissance aux néphrons matures. La prolifération cellulaire est un indice de la dynamique des populations de cellules progénitrices. La quantification in situ précise et reproductible de la prolifération cellulaire au sein de populations de cellules progénitrices peut cependant s'avérer techniquement difficile à réaliser en raison de la complexité et de la sévérité du traitement tissulaire requis par certains protocoles. OBJECTIF: Optimiser et comparer la performance des trois plus précises méthodes de marquage spécifiques à la phase S pour détecter et quantifier in situ la prolifération des cellules progénitrices de néphrons et de bourgeons urétéraux dans le rein en développement, à savoir la 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU), la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU), et l'antigène nucléaire de prolifération cellulaire (PCNA). MÉTHODOLOGIE: Les protocoles pour BrdU, EdU et PCNA ont été optimisés pour le marquage fluorescent de coupes de tissus rénaux de souris, fixés au paraformaldéhyde et enchassés dans la paraffine, avec co-marquage des cellules progénitrices de néphrons et de bourgeons urétéraux avec les anticorps Six2 et E-cadhérine, respectivement. Le traitement et l'analyse des images, y compris la quantification des cellules en prolifération, ont été réalisés à l'aide du logiciel gratuit ImageJ. RÉSULTATS: Les trois méthodes ont détecté des ratios similaires de cellules progénitrices de néphrons et de bourgeons urétéraux en prolifération. Le protocole de coloration BrdU est le plus long et le plus complexe à effectuer. Il requiert la dénaturation des tissus et il est le plus sujet à la variabilité du signal inter-expériences. En revanche, les protocoles de liaison de PCNA et d'EdU sont relativement plus simples, donnent systématiquement des résultats clairs et se prêtent beaucoup plus facilement à la coloration conjointe. Toutefois, le protocole de liaison de PCNA requiert une analyse supplémentaire approfondie post-expérience pour distinguer le schéma de coloration ponctuée du noyau caractéristique des cellules en prolifération. CONCLUSION: Les trois méthodes ont montré des avantages et des inconvénients distincts pour la quantification de la prolifération cellulaire des populations de cellules progénitrices du rein. Les protocoles avec EdU et PCNA sont favorisés en raison de leur simplicité technique et de la reproductibilité des résultats obtenus.

Osteogenic potential of sorted equine mesenchymal stem cell subpopulations.

The objectives of this study were to use non-equilibrium gravitational field-flow fractionation (GrFFF), an immunotag-less method of sorting mesenchymal stem cells (MSCs), to sort equine muscle tissue-derived mesenchymal stem cells (MMSCs) and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSC) into subpopulations and to carry out assays in order to compare their osteogenic capabilities. Cells from 1 young adult horse were isolated from left semitendinosus muscle tissue and from bone marrow aspirates of the fourth and fifth sternebrae. Aliquots of 800 × 10(3) MSCs from each tissue source were sorted into 5 fractions using non-equilibrium GrFFF (GrFFF proprietary system). Pooled fractions were cultured and expanded for use in osteogenic assays, including flow cytometry, histochemistry, bone nodule assays, and real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for gene expression of osteocalcin (OCN), RUNX2, and osterix. Equine MMSCs and BMSCs were consistently sorted into 5 fractions that remained viable for use in further osteogenic assays. Statistical analysis confirmed strongly significant upregulation of OCN, RUNX2, and osterix for the BMSC fraction 4 with P < 0.00001. Flow cytometry revealed different cell size and granularity for BMSC fraction 4 and MMSC fraction 2 compared to unsorted controls and other fractions. Histochemisty and bone nodule assays revealed positive staining nodules without differences in average nodule area, perimeter, or stain intensity between tissues or fractions. As there are different subpopulations of MSCs with different osteogenic capacities within equine muscle- and bone marrow-derived sources, these differences must be taken into account when using equine stem cell therapy to induce bone healing in veterinary medicine.

Les objectifs de la présente étude étaient d'utiliser une méthode non-équilibrée de fractionnement par flot sous champs gravitationnel (GrFFF), une méthode sans marquage immunologique de séparation des cellules souches mésenchymateuses (MSCs), afin de séparer les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu musculaire équin (MMSCs) et les cellules souches mésenchymateuses provenant de la moelle osseuse (BMSCs) en sous-populations et de réaliser des essais afin de comparer leurs capacités ostéogéniques. Des cellules provenant d'un jeune cheval adulte furent isolées du muscle semi-tendineux gauche et d'aspirations de la moelle osseuse de la quatrième et cinquième strernèbre. Des aliquotes de 800 × 103 MSCs provenant de chaque source de tissu furent séparés en 5 fractions par GrFFF non-équilibré (système breveté GrFFF). Des fractions regroupées ont été mises en culture afin de proliférer pour utilisation dans des essais ostéogéniques, incluant la cytométrie en flux, l'histochimie, des essais de nodules osseux, et l'amplification en chaine quantitative par la polymérase (qPCR) pour l'expression des gènes de l'ostéocalcine (OCN), RUNX2, et osterix. Les MMSCs et BMSCs équins étaient séparés de manière constante en 5 fractions qui demeuraient viables pour utilisation dans des essais ostéogéniques additionnels. Les analyses statistiques ont confirmé une régulation à la hausse très significative pour OCN, RUNX2 et osterix pour la fraction 4 des BMSC (P < 0,00001). La cytométrie en flux a révélé une taille et une granularité différente pour la fraction 4 des BMSCs et la fraction 2 des MMSCs comparativement aux témoins non-séparés et aux autres fractions. L'histochimie et les essais de nodules osseux ont révélé des nodules se colorant positivement sans différence pour les tissus ou les fractions dans la moyenne de la surface du nodule, du périmètre, ou de l'intensité de la coloration. Étant donné qu'il y a différentes sous-populations de MSCs avec différentes capacités ostéogéniques parmi les sources dérivées du muscle et de la moelle osseuse, ces différences doivent être prises en compte lors de l'utilisation thérapeutique en médecine vétérinaire des cellules souches pour induire la guérison osseuse.(Traduit par Docteur Serge Messier).

Application of a novel sorting system for equine mesenchymal stem cells (MSCs).

The objective of this study was to validate non-equilibrium gravitational field-flow fractionation (GrFFF), an immunotag-less method of sorting mesenchymal stem cells (MSCs) into subpopulations, for use with MSCs derived from equine muscle tissue, periosteal tissue, bone marrow, and adipose tissue. Cells were collected from 6 young, adult horses, postmortem. Cells were isolated from left semitendinosus muscle tissue, periosteal tissue from the distomedial aspect of the right tibia, bone marrow aspirates from the fourth and fifth sternebrae, and left supragluteal subcutaneous adipose tissue. Aliquots of 800 × 10(3) MSCs from each tissue source were separated and injected into a ribbon-like capillary device by continuous flow (GrFFF proprietary system). Cells were sorted into 6 fractions and absorbencies [optical density (OD)] were read. Six fractions from each of the 6 aliquots were then combined to provide pooled fractions that had adequate cell numbers to seed at equal concentrations into assays. Equine muscle tissue-derived, periosteal tissue-derived, bone marrow-derived, and adipose tissue-derived mesenchymal stem cells were consistently sorted into 6 fractions that remained viable for use in further assays. Fraction 1 had more cuboidal morphology in culture when compared to the other fractions. Statistical analysis of the fraction absorbencies (OD) revealed a P-value of < 0.05 when fractions 2 and 3 were compared to fractions 1, 4, 5, and 6. It was concluded that non-equilibrium GrFFF is a valid method for sorting equine muscle tissue-derived, periosteal tissue-derived, bone marrow-derived, and adipose tissue-derived mesenchymal stem cells into subpopulations that remain viable, thus securing its potential for use in equine stem cell applications and veterinary medicine.

L'objectif de la présente étude était de valider une méthode non-équilibrée de fractionnement par flot sous champs gravitationnel (GrFFF), une méthode sans marquage immunologique de séparation des cellules souches mésenchymateuses (MSCs) en sous-populations, pour utilisations avec des MSCs provenant de tissu musculaire, de tissu de périoste, de moelle osseuse, et de tissu adipeux de chevaux. Les cellules furent prélevées post-mortem à partir de six jeunes chevaux adultes. Les cellules furent isolées du muscle semi-tendineux gauche, du périoste de l'aspect disto-médial du tibia droit, d'aspirations de moelle osseuse de la quatrième et cinquième sternèbres, et du tissu adipeux sous-cutané de la région supra-glutéale gauche. Des aliquots de 800 × 103 MSCs de chaque tissu ont été séparés et injectés dans un appareil capillaire apparenté à un ruban par flot continu (système breveté GrFFF). Les cellules furent séparées en six fractions et les absorbances [densité optique (OD)] notées. Six fractions de chacun des six aliquots furent par la suite combinées afin de fournir des fractions poolées qui avaient des nombres adéquats de cellules pour ensemencer des concentrations égales dans les essais. Les MSCs provenant du tissu musculaire, du périoste, de la moelle osseuse, et du tissu adipeux étaient de manière constante séparées en six fractions qui sont demeurées viables pour utilisation dans des essais ultérieurs. La fraction 1 avait plus de cellules de morphologie cuboïde comparativement aux autres fractions. Les analyses statistiques des OD des fractions ont révélé une valeur de P < 0,05 lorsque les fractions 2 et 3 étaient comparées aux fractions 1, 4, 5, et 6. Il fut conclu que la méthode GrFFF non-équilibrée est une méthode valide pour séparer les MSCs équines dérivées des cellules musculaires, du périoste, de la moelle osseuse, et du tissu adipeux en sous-populations qui demeurent viables, assurant ainsi son potentiel pour utilisation en médecine vétérinaire et les applications avec les cellules souches équines.(Traduit par Docteur Serge Messier).

Evaluation of an in vivo heterotopic model of osteogenic differentiation of equine bone marrow and muscle mesenchymal stem cells in fibrin glue scaffold.

Autologous mesenchymal stem cells (MSCs) have been used as a potential cell-based therapy in various animal and human diseases. Their differentiation capacity makes them useful as a novel strategy in the treatment of tissue injury in which the healing process is compromised or delayed. In horses, bone healing is slow, taking a minimum of 6-12 months. The osteogenic capacity of equine bone marrow and muscle MSCs mixed with fibrin glue or phosphate-buffered saline (PBS) as a scaffold is assessed. Bone production by the following groups was compared: Group 1, bone marrow (BM) MSCs in fibrin glue; Group 2, muscle (M) MSCs in fibrin glue; Group 3, BM MSCs in PBS; Group 4, M MSCs in PBS and as a control; Group 5, fibrin glue without cells. BM and M MSCs underwent osteogenic stimulation for 48 h prior to being injected intramuscularly into nude mice. After 4 weeks, the mice were killed and muscle samples were collected and evaluated for bone formation and mineralization by using radiology, histochemistry and immunohistochemistry. Positive bone formation and mineralization were confirmed in Group 1 in nude mice based on calcium deposition and the presence of osteocalcin and collagen type I; in addition, a radiopaque area was observed on radiographs. However, no evidence of mineralization or bone formation was observed in Groups 2-5. In this animal model, equine BM MSCs mixed with fibrin glue showed better osteogenic differentiation capacity compared with BM MSCs in PBS and M MSCs in either carrier.

Characterization and osteogenic potential of equine muscle tissue- and periosteal tissue-derived mesenchymal stem cells in comparison with bone marrow- and adipose tissue-derived mesenchymal stem cells.

OBJECTIVE: To characterize equine muscle tissue- and periosteal tissue-derived cells as mesenchymal stem cells (MSCs) and assess their proliferation capacity and osteogenic potential in comparison with bone marrow- and adipose tissue-derived MSCs. SAMPLE: Tissues from 10 equine cadavers. PROCEDURES: Cells were isolated from left semitendinosus muscle tissue, periosteal tissue from the distomedial aspect of the right tibia, bone marrow aspirates from the fourth and fifth sternebrae, and adipose tissue from the left subcutaneous region. Mesenchymal stem cells were characterized on the basis of morphology, adherence to plastic, trilineage differentiation, and detection of stem cell surface markers via immunofluorescence and flow cytometry. Mesenchymal stem cells were tested for osteogenic potential with osteocalcin gene expression via real-time PCR assay. Mesenchymal stem cell cultures were counted at 24, 48, 72, and 96 hours to determine tissue-specific MSC proliferative capacity. RESULTS: Equine muscle tissue- and periosteal tissue-derived cells were characterized as MSCs on the basis of spindle-shaped morphology, adherence to plastic, trilineage differentiation, presence of CD44 and CD90 cell surface markers, and nearly complete absence of CD45 and CD34 cell surface markers. Muscle tissue-, periosteal tissue-, and adipose tissue-derived MSCs proliferated significantly faster than did bone marrow-derived MSCs at 72 and 96 hours. CONCLUSIONS AND CLINICAL RELEVANCE: Equine muscle and periosteum are sources of MSCs. Equine muscle- and periosteal-derived MSCs have osteogenic potential comparable to that of equine adipose- and bone marrow-derived MSCs, which could make them useful for tissue engineering applications in equine medicine.

Scaffold effects on osteogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: an in vitro comparative study.

The in vitro viability, osteogenic differentiation, and mineralization of four different equine mesenchymal stem cells (MSCs) from bone marrow, periosteum, muscle, and adipose tissue are compared, when they are cultured with different collagen-based scaffolds or with fibrin glue. The results indicate that bone marrow cells are the best source of MSCs for osteogenic differentiation, and that an electrochemically aggregated collagen gives the highest cell viability and best osteogenic differentiation among the four kinds of scaffolds studied.

Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum.

OBJECTIVE: To isolate and characterize mesenchymal stem cells (MSCs) from canine muscle and periosteum and compare proliferative capacities of bone marrow-, adipose tissue-, muscle-, and periosteum-derived MSCs (BMSCs, AMSCs, MMSCs, and PMSCs, respectively). SAMPLE: -7 canine cadavers. PROCEDURES: -MSCs were characterized on the basis of morphology, immunofluorescence of MSC-associated cell surface markers, and expression of pluripotency-associated transcription factors. Morphological and histochemical methods were used to evaluate differentiation of MSCs cultured in adipogenic, osteogenic, and chondrogenic media. Messenger ribonucleic acid expression of alkaline phosphatase, RUNX2, OSTERIX, and OSTEOPONTIN were evaluated as markers for osteogenic differentiation. Passage-1 MSCs were counted at 24, 48, 72, and 96 hours to determine tissue-specific MSC proliferative capacity. Mesenchymal stem cell yield per gram of tissue was calculated for confluent passage-1 MSCs. RESULTS: -Successful isolation of BMSCs, AMSCs, MMSCs, and PMSCs was determined on the basis of morphology; expression of CD44 and CD90; no expression of CD34 and CD45; mRNA expression of SOX2, OCT4, and NANOG; and adipogenic and osteogenic differentiation. Proliferative capacity was not significantly different among BMSCs, AMSCs, MMSCs, and PMSCs over a 4-day culture period. Periosteum provided a significantly higher MSC yield per gram of tissue once confluent in passage 1 (mean ± SD of 19,400,000 ± 12,800,000 of PMSCs/g of periosteum obtained in a mean ± SD of 13 ± 1.64 days). CONCLUSIONS AND CLINICAL RELEVANCE: -Results indicated that canine muscle and periosteum may be sources of MSCs. Periosteum was a superior tissue source for MSC yield and may be useful in allogenic applications.