Gene expression and in vitro nuclear maturation in bovine cumulus oocyte complexes maturated in a medium supplemented with bovine fetal serum or bovine serum albumin / Gene expression and in vitro nuclear maturation in bovine cumulus oocyte complexes maturated in a medium supplemented with bovine fetal serum or bovine serum albumin

Background: The expansion and mucification of granulosa cells of the cumulus oophorus-oocyte complex (COC) is observed during the oocyte in vitro maturation (IVM) as a result of the intense synthesis of extracellular matrix (ECM) components. These changes in cumulus aspect are indicative of maturation and may be influenced by oocyte-related factors and by IVM conditions. The objectives of the present study were (i) to assess the expression of gene transcripts that codify for the proteins hyaluronan synthase-2 (HAS2), link protein 1, connexin 43 and -actin in bovine cumulus oophorus-oocyte complexes (COCs) before and after IVM, and (ii) to determine nuclear maturation rates of oocytes submitted to IVM. Materials, Methods & Results: Bovine COCs obtained from abattoir-derived ovaries were analyzed and selected for morphological aspects and divided in three experimental groups: G1, COCs submitted to IVM; G2, COCs submitted to IVM in medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS); and G3, COCs submitted to IVM in medium supplemented with bovine serum albumin (BSA). After extraction of the messenger RNA (mRNA) of COCs, cDNA was extracted and fragments of the gene transcripts were amplified using the reverse transcription (RT) and the polymerase chain reaction (PCR). The RT-PCR products were electrophoresed in agarose gels and amplification intensity was quantified to obta

Background: The expansion and mucification of granulosa cells of the cumulus oophorus-oocyte complex (COC) is observed during the oocyte in vitro maturation (IVM) as a result of the intense synthesis of extracellular matrix (ECM) components. These changes in cumulus aspect are indicative of maturation and may be influenced by oocyte-related factors and by IVM conditions. The objectives of the present study were (i) to assess the expression of gene transcripts that codify for the proteins hyaluronan synthase-2 (HAS2), link protein 1, connexin 43 and -actin in bovine cumulus oophorus-oocyte complexes (COCs) before and after IVM, and (ii) to determine nuclear maturation rates of oocytes submitted to IVM. Materials, Methods & Results: Bovine COCs obtained from abattoir-derived ovaries were analyzed and selected for morphological aspects and divided in three experimental groups: G1, COCs submitted to IVM; G2, COCs submitted to IVM in medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS); and G3, COCs submitted to IVM in medium supplemented with bovine serum albumin (BSA). After extraction of the messenger RNA (mRNA) of COCs, cDNA was extracted and fragments of the gene transcripts were amplified using the reverse transcription (RT) and the polymerase chain reaction (PCR). The RT-PCR products were electrophoresed in agarose gels and amplification intensity was quantified to obta

Gene expression and in vitro nuclear maturation in bovine cumulus oocyte complexes maturated in a medium supplemented with bovine fetal serum or bovine serum albumin / Gene expression and in vitro nuclear maturation in bovine cumulus oocyte complexes maturated in a medium supplemented with bovine fetal serum or bovine serum albumin

Background: The expansion and mucification of granulosa cells of the cumulus oophorus-oocyte complex (COC) is observed during the oocyte in vitro maturation (IVM) as a result of the intense synthesis of extracellular matrix (ECM) components. These changes in cumulus aspect are indicative of maturation and may be influenced by oocyte-related factors and by IVM conditions. The objectives of the present study were (i) to assess the expression of gene transcripts that codify for the proteins hyaluronan synthase-2 (HAS2), link protein 1, connexin 43 and -actin in bovine cumulus oophorus-oocyte complexes (COCs) before and after IVM, and (ii) to determine nuclear maturation rates of oocytes submitted to IVM. Materials, Methods & Results: Bovine COCs obtained from abattoir-derived ovaries were analyzed and selected for morphological aspects and divided in three experimental groups: G1, COCs submitted to IVM; G2, COCs submitted to IVM in medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS); and G3, COCs submitted to IVM in medium supplemented with bovine serum albumin (BSA). After extraction of the messenger RNA (mRNA) of COCs, cDNA was extracted and fragments of the gene transcripts were amplified using the reverse transcription (RT) and the polymerase chain reaction (PCR). The RT-PCR products were electrophoresed in agarose gels and amplification intensity was quantified to obta

Background: The expansion and mucification of granulosa cells of the cumulus oophorus-oocyte complex (COC) is observed during the oocyte in vitro maturation (IVM) as a result of the intense synthesis of extracellular matrix (ECM) components. These changes in cumulus aspect are indicative of maturation and may be influenced by oocyte-related factors and by IVM conditions. The objectives of the present study were (i) to assess the expression of gene transcripts that codify for the proteins hyaluronan synthase-2 (HAS2), link protein 1, connexin 43 and -actin in bovine cumulus oophorus-oocyte complexes (COCs) before and after IVM, and (ii) to determine nuclear maturation rates of oocytes submitted to IVM. Materials, Methods & Results: Bovine COCs obtained from abattoir-derived ovaries were analyzed and selected for morphological aspects and divided in three experimental groups: G1, COCs submitted to IVM; G2, COCs submitted to IVM in medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS); and G3, COCs submitted to IVM in medium supplemented with bovine serum albumin (BSA). After extraction of the messenger RNA (mRNA) of COCs, cDNA was extracted and fragments of the gene transcripts were amplified using the reverse transcription (RT) and the polymerase chain reaction (PCR). The RT-PCR products were electrophoresed in agarose gels and amplification intensity was quantified to obta

Expressão gênica das células do cumulus oophorus de bovinos após a vitrificação

Um dos desafios da criobiologia continua sendo o desenvolvimento de um método que proporcione a manutenção da viabilidade após a criopreservação de oócitos imaturos na espécie bovina. A vitrificação tem sido a metodologia que proporciona resultados de sobrevivência após a criopreservação mais promissores para complexos  cumulus-oócito (CCOs) imaturos bovinos. Entretanto, a ação dos crioprotetores sobre as células do cumulus oophorus, no que diz respeito à regulação da expressão de genes importantes nesta fase, ainda é pouco compreendida. O objetivo do trabalho foi avaliar a expressão gênica das proteínas ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), conexina 43 (GJA1) e proteína de choque térmico HSP70-1 (HSP70-1) em células do cumulus oophorus de oócitos imaturos bovinos submetidos a exposição e/ou vitrificação na solução crioprotetora (SV) composta por 20% de etileno glicol (EG) + 20% dimetil sulfóxido (DMSO) + 0,5M de sacarose. Os CCOs foram selecionados e distribuídos em 4 grupos experimentais: G1, CCOs não submetidos a maturação in vitro (MIV); G2, CCOs submetidos à MIV; G3, CCOs maturados após a exposição à SV; e G4, CCOs maturados após a vitrificação com a SV. A MIV foi realizada em TCM 199, suplementado com soro de égua em estro, à 39oC, 5% de CO2 e máxima umidade relativa, por 22 a 24 horas. A extração do RNA das amostras de células do cumulus foi realizad

Expressão gênica das células do cumulus oophorus de bovinos após a vitrificação

Um dos desafios da criobiologia continua sendo o desenvolvimento de um método que proporcione a manutenção da viabilidade após a criopreservação de oócitos imaturos na espécie bovina. A vitrificação tem sido a metodologia que proporciona resultados de sobrevivência após a criopreservação mais promissores para complexos  cumulus-oócito (CCOs) imaturos bovinos. Entretanto, a ação dos crioprotetores sobre as células do cumulus oophorus, no que diz respeito à regulação da expressão de genes importantes nesta fase, ainda é pouco compreendida. O objetivo do trabalho foi avaliar a expressão gênica das proteínas ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), conexina 43 (GJA1) e proteína de choque térmico HSP70-1 (HSP70-1) em células do cumulus oophorus de oócitos imaturos bovinos submetidos a exposição e/ou vitrificação na solução crioprotetora (SV) composta por 20% de etileno glicol (EG) + 20% dimetil sulfóxido (DMSO) + 0,5M de sacarose. Os CCOs foram selecionados e distribuídos em 4 grupos experimentais: G1, CCOs não submetidos a maturação in vitro (MIV); G2, CCOs submetidos à MIV; G3, CCOs maturados após a exposição à SV; e G4, CCOs maturados após a vitrificação com a SV. A MIV foi realizada em TCM 199, suplementado com soro de égua em estro, à 39oC, 5% de CO2 e máxima umidade relativa, por 22 a 24 horas. A extração do RNA das amostras de células do cumulus foi realizad

Análise da contaminação por Salmonella em ovos do tipo colonial através da reação em cadeia da polimerase

The identification of salmonella infection in commercial poultry has been one of the strong points of prophylaxis and consequent reduction of salmonellosis outbreaks in humans associated to consumption of eggs, considering that the analysis of the eggs can be one more point of detection of infection, which for many times appear without clinical signs. The Polymerase Chain Reaction (PCR) seems to be a useful strategy for Salmonella detection, because various authors have used the PCR to verify the presence of bacteria in meat, feces, tissues, blood, milk and eggs, with different methods of manipulation of samples. We have analyzed 360 eggs from ten farms, producers of free range-eggs, in the district of Camobi, in Santa Maria - RS - Brasil. The eggs were grouped in pools of six, totaling sixty samples. The bacteriological exam was done in compliance with the method preconized by the technical rules and the method for extraction of DNA was by phenol-chloroform. The PCR was performed for the amplification of a 284 bp DNA fragment. The analysis of the results do not show significant difference between the PCR and the bacteriological exam. All positive samples in the bacteriological exam were also positive by PCR, however the PCR detected more two samples due to higher sensitivity and specificity, specially when it is known that the eggs show a mixed population of germs that many times difficult isolation of salmonellas in the bacteriological exam because of the competition with normal flora bacteria.

A identificação de poedeiras comerciais infectadas por salmonelas tem sido um dos pontos fortes da profilaxia e conseqüente redução de surtos de salmonelose em humanos associados ao consumo de ovos, sendo que a análise dos ovos pode ser mais um dos pontos de detecção da infecção, que, muitas vezes, cursa sem sinais clínicos. A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) parece ser uma estratégia útil para detecção de Salmonella, pois vários autores têm utilizado a PCR para verificar a presença da bactéria em carnes, fezes, tecidos, sangue, leite e ovos, com diferentes metodologias de manipulação das amostras. Foram analisados 360 ovos, procedentes de dez propriedades rurais, produtoras de ovos tipo colonial, no distrito de Camobi, em Santa Maria - RS. Os ovos foram divididos em grupos de seis, totalizando sessenta amostras. O exame bacteriológico foi realizado conforme metodologia preconizada pelas normas técnicas e a metodologia de extração de DNA pelo fenol-clorofórmio. A PCR foi realizada para a amplificação de um fragmento de DNA de 284 pb. A análise dos resultados não demonstrou diferença significativa entre a PCR e o bacteriológico. Todas as amostras positivas ao bacteriológico foram positivas na PCR, sendo que essa última detectou duas amostras a mais, devido a sua alta sensibilidade e especificidade, especialmente quando é sabido que os ovos apresentam uma população microbiana mista que, muitas vezes, impede o isolamento adequado das salmonelas no bacteriológico pela competição com a flora bacteriana normalmente presente.

Análise da contaminação por Salmonella em ovos do tipo colonial através da reação em cadeia da polimerase

The identification of salmonella infection in commercial poultry has been one of the strong points of prophylaxis and consequent reduction of salmonellosis outbreaks in humans associated to consumption of eggs, considering that the analysis of the eggs can be one more point of detection of infection, which for many times appear without clinical signs. The Polymerase Chain Reaction (PCR) seems to be a useful strategy for Salmonella detection, because various authors have used the PCR to verify the presence of bacteria in meat, feces, tissues, blood, milk and eggs, with different methods of manipulation of samples. We have analyzed 360 eggs from ten farms, producers of free range-eggs, in the district of Camobi, in Santa Maria - RS - Brasil. The eggs were grouped in pools of six, totaling sixty samples. The bacteriological exam was done in compliance with the method preconized by the technical rules and the method for extraction of DNA was by phenol-chloroform. The PCR was performed for the amplification of a 284 bp DNA fragment. The analysis of the results do not show significant difference between the PCR and the bacteriological exam. All positive samples in the bacteriological exam were also positive by PCR, however the PCR detected more two samples due to higher sensitivity and specificity, specially when it is known that the eggs show a mixed population of germs that many times difficult isolation of salmonellas in the bacteriological exam because of the competition with normal flora bacteria.

A identificação de poedeiras comerciais infectadas por salmonelas tem sido um dos pontos fortes da profilaxia e conseqüente redução de surtos de salmonelose em humanos associados ao consumo de ovos, sendo que a análise dos ovos pode ser mais um dos pontos de detecção da infecção, que, muitas vezes, cursa sem sinais clínicos. A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) parece ser uma estratégia útil para detecção de Salmonella, pois vários autores têm utilizado a PCR para verificar a presença da bactéria em carnes, fezes, tecidos, sangue, leite e ovos, com diferentes metodologias de manipulação das amostras. Foram analisados 360 ovos, procedentes de dez propriedades rurais, produtoras de ovos tipo colonial, no distrito de Camobi, em Santa Maria - RS. Os ovos foram divididos em grupos de seis, totalizando sessenta amostras. O exame bacteriológico foi realizado conforme metodologia preconizada pelas normas técnicas e a metodologia de extração de DNA pelo fenol-clorofórmio. A PCR foi realizada para a amplificação de um fragmento de DNA de 284 pb. A análise dos resultados não demonstrou diferença significativa entre a PCR e o bacteriológico. Todas as amostras positivas ao bacteriológico foram positivas na PCR, sendo que essa última detectou duas amostras a mais, devido a sua alta sensibilidade e especificidade, especialmente quando é sabido que os ovos apresentam uma população microbiana mista que, muitas vezes, impede o isolamento adequado das salmonelas no bacteriológico pela competição com a flora bacteriana normalmente presente.

A CONTRIBUIÇÃO DO GENE HALOTANO SOBRE AS CARACTERÍSTICAS DE QUALIDADE DA CARNE SUÍNA

The aim of this research work was to evaluate the effect of the halothane gene on the quality characteristics of pork. Commercial hybrid pig carcasses (151) were used for the trial, 93 with normal halothane genotype (HalNN), 51 heterozygous genotype (HalNn) and 7 homozigous recessive genotype (Hal nn). The measured attributes were backfat and muscle depth, meat percentage, carcass weight and pH at 45 minutes and 24 hours after the slaughter, on the Longissimus dorsi muscle, color, drip loss, and identification of the halothane genotype was determined in fat samples through PCR-RFLP technique. The HalNn pigs presented greater muscle depth and meat percentage than HalNN ones. Significant differences were observed between HalNn and HalNN pigs in relation to the inicial pH and meat color. The halothane genotype did not affect the backfat thickness, final pH and water holding capacity. Differences between carcass quality from the HalNn and the nn pigs in relation to the backfat thickness, muscle depth and the meat percentage were not observed. Differences between quantity and quality of pork seems to be associated to the presence of the halothane gene.

O objetivo deste trabalho foi o de avaliar o efeito do gene halotano sobre as características de qualidade da carne suína. Foram utilizadas 151 carcaças de suínos híbridos comerciais, sendo 93 carcaças com genótipo halotano normal (HalNN), 51 heterozigotos (HalNn) e 7 recessivas (Hal nn). As medidas efetuadas foram: espessura de toucinho e de músculo, percentagem de carne, peso da carcaça, pH aos 45 minutos e 24 horas após o abate, no músculo Longissimus dorsi, cor, perda de líquido por gotejamento e identificação do genótipo halotano em amostras de gordura através de PCR-RFLP. Suínos HalNn apresentaram maior espessura de músculo e percentagem de carne do que os suínos HalNN. Houve diferença significativa entre suínos HalNn e HalNN quanto ao pH inicial e à cor . Em relação à espessura de toucinho, pH final e perda de líquido, não houve diferença significativa entre os genótipos. A qualidade da carne de suínos HalNn foi inferior à de suínos HalNN, em termos de pH e cor. A qualidade da carcaça de suínos HalNn não se mostrou melhor do que a dos suínos Hal nn, em relação à espessura de toucinho e músculo e à percentagem de carne. A relação entre quantidade e qualidade da carne parece depender da presença do gene halotano.

A contribuição do gene halotano sobre as características de qualidade da carne suína

The aim of this research work was to evaluate the effect of the halothane gene on the quality characteristics of pork. Commercial hybrid pig carcasses (151) were used for the trial, 93 with normal halothane genotype (HalNN), 51 heterozygous genotype (HalNn) and 7 homozigous recessive genotype (Hal nn). The measured attributes were backfat and muscle depth, meat percentage, carcass weight and pH at 45 minutes and 24 hours after the slaughter, on the Longissimus dorsi muscle, color, drip loss, and identification of the halothane genotype was determined in fat samples through PCR-RFLP technique. The HalNn pigs presented greater muscle depth and meat percentage than HalNN ones. Significant differences were observed between HalNn and HalNN pigs in relation to the inicial pH and meat color. The halothane genotype did not affect the backfat thickness, final pH and water holding capacity. Differences between carcass quality from the HalNn and the nn pigs in relation to the backfat thickness, muscle depth and the meat percentage were not observed. Differences between quantity and quality of pork seems to be associated to the presence of the halothane gene.

O objetivo deste trabalho foi o de avaliar o efeito do gene halotano sobre as características de qualidade da carne suína. Foram utilizadas 151 carcaças de suínos híbridos comerciais, sendo 93 carcaças com genótipo halotano normal (HalNN), 51 heterozigotos (HalNn) e 7 recessivas (Hal nn). As medidas efetuadas foram: espessura de toucinho e de músculo, percentagem de carne, peso da carcaça, pH aos 45 minutos e 24 horas após o abate, no músculo Longissimus dorsi, cor, perda de líquido por gotejamento e identificação do genótipo halotano em amostras de gordura através de PCR-RFLP. Suínos HalNn apresentaram maior espessura de músculo e percentagem de carne do que os suínos HalNN. Houve diferença significativa entre suínos HalNn e HalNN quanto ao pH inicial e à cor . Em relação à espessura de toucinho, pH final e perda de líquido, não houve diferença significativa entre os genótipos. A qualidade da carne de suínos HalNn foi inferior à de suínos HalNN, em termos de pH e cor. A qualidade da carcaça de suínos HalNn não se mostrou melhor do que a dos suínos Hal nn, em relação à espessura de toucinho e músculo e à percentagem de carne. A relação entre quantidade e qualidade da carne parece depender da presença do gene halotano.

MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE DNA PARA A DETECÇÃO DE Salmonella EM OVOS DE GALINHAS, COM E SEM CASCA, ATRAVÉS DA REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE

The Salmonella sp detection in feed samples is time consuming, it has five stages and requires 120 hours for final results. The use of polimerase chain reaction technique can reduce this time considerably, however it can be affected by substances from the sample. This study had the objective of comparing two methods of DNA extraction, by heating process and by phenol-chloroform in samples of 100 chicken eggs experimentally infected with a sample of Salmonella enterica sorovar typhimurium in stationary phase. After the two extraction methods a PCR was done using a pair of oligonucleotides that amplifies a fragment of 284pb in the InvA gene de Salmonella sp. Comparing the extraction methods it was noted a difference of 12% favorably to the phenol-chloroform method when the extraction was done from eggs with shell. The same method using just the egg internal part resulted in a difference of 26% with high significance (P 0.003), showing that the method used was determinant to improve the technique efficiency. However, comparing the positive percentage independent of the DNA extraction method a significant difference (P 0.047) was noted for outshell eggs. This fact suggests that for Salmonella egg analysis, only the egg internal part should be used because the shell can determine interference in technique.

O diagnóstico microbiológico de Salmonella sp em amostras de alimentos é demorado, com cinco diferentes etapas, levando cerca de 120 horas até o resultado final. A utilização da técnica da Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) pode diminuir esse período, porém sofre influência de substâncias presentes na amostra que afetam a reação. O objetivo deste trabalho foi comparar dois métodos de extração de DNA, a extração por tratamento térmico e a pelo fenol-clorofórmio, em amostras de 100 ovos de galinhas domésticas artificialmente contaminados com uma cepa de Salmonella enterica sorovar typhimurium em fase estacionária. O material obtido com as extrações foi submetido à PCR, utilizando-se um par de iniciadores que amplificam um fragmento de 284pb do gene InvA de Salmonella sp. Comparando os métodos de extração, observou-se uma diferença na capacidade de detecção de 12% a favor do método do fenol-clorofórmio, quando a extração foi realizada a partir do ovo com casca. No momento em que a mesma metodologia foi usada apenas com a parte interna dos ovos, essa diferença subiu para 26% o que foi significativo (P 0,003), demonstrando que a metodologia de extração foi determinante para melhorar a sensibilidade da técnica. No entanto, ao comparar-se a percentagem de positivos independente da técnica de extração do DNA, observou-se diferença significativa (P 0,047) a favor das amostras de ovos sem casca. Isso sugere que para a detecção de Salmonella por PCR deve-seutilizar apenas a parte interna dos ovos, pois a casca pode determinar interferência na técnica.

MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE DNA PARA A DETECÇÃO DE Salmonella EM OVOS DE GALINHAS, COM E SEM CASCA, ATRAVÉS DA REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE

The Salmonella sp detection in feed samples is time consuming, it has five stages and requires 120 hours for final results. The use of polimerase chain reaction technique can reduce this time considerably, however it can be affected by substances from the sample. This study had the objective of comparing two methods of DNA extraction, by heating process and by phenol-chloroform in samples of 100 chicken eggs experimentally infected with a sample of Salmonella enterica sorovar typhimurium in stationary phase. After the two extraction methods a PCR was done using a pair of oligonucleotides that amplifies a fragment of 284pb in the InvA gene de Salmonella sp. Comparing the extraction methods it was noted a difference of 12% favorably to the phenol-chloroform method when the extraction was done from eggs with shell. The same method using just the egg internal part resulted in a difference of 26% with high significance (P 0.003), showing that the method used was determinant to improve the technique efficiency. However, comparing the positive percentage independent of the DNA extraction method a significant difference (P 0.047) was noted for outshell eggs. This fact suggests that for Salmonella egg analysis, only the egg internal part should be used because the shell can determine interference in technique.

O diagnóstico microbiológico de Salmonella sp em amostras de alimentos é demorado, com cinco diferentes etapas, levando cerca de 120 horas até o resultado final. A utilização da técnica da Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) pode diminuir esse período, porém sofre influência de substâncias presentes na amostra que afetam a reação. O objetivo deste trabalho foi comparar dois métodos de extração de DNA, a extração por tratamento térmico e a pelo fenol-clorofórmio, em amostras de 100 ovos de galinhas domésticas artificialmente contaminados com uma cepa de Salmonella enterica sorovar typhimurium em fase estacionária. O material obtido com as extrações foi submetido à PCR, utilizando-se um par de iniciadores que amplificam um fragmento de 284pb do gene InvA de Salmonella sp. Comparando os métodos de extração, observou-se uma diferença na capacidade de detecção de 12% a favor do método do fenol-clorofórmio, quando a extração foi realizada a partir do ovo com casca. No momento em que a mesma metodologia foi usada apenas com a parte interna dos ovos, essa diferença subiu para 26% o que foi significativo (P 0,003), demonstrando que a metodologia de extração foi determinante para melhorar a sensibilidade da técnica. No entanto, ao comparar-se a percentagem de positivos independente da técnica de extração do DNA, observou-se diferença significativa (P 0,047) a favor das amostras de ovos sem casca. Isso sugere que para a detecção de Salmonella por PCR deve-seutilizar apenas a parte interna dos ovos, pois a casca pode determinar interferência na técnica.