Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for recombinant human gamma interferon.

A one-site ELISA for the quantification of recombinant human gamma interferon (rh-IFN-gamma) was developed and validated. A single monoclonal antibody (Mab) was used as a "catching" antibody and as a horseradish peroxidase (HRP)-labeled conjugate. Detection limit and quantification limit of this assay were estimated to be 1.26 and 15 ng/mL, respectively, and the coefficient of variation was below 15%. The ELISA was specific for rh-IFN-gamma, showing no cross reactivity to other related molecules in the range of the concentrations studied. The results correlated well with those obtained by a bioassay method. By using this assay, it was demonstrated that 0.01-1% (v/v) Tween 80 protected rh-IFN-gamma during freezing and thawing.

Thermal denaturation of human gamma-interferon. A calorimetric and spectroscopic study.

The thermal denaturation of a recombinant human gamma-interferon has been studied as a function of pH in the range from 2 to 10 and buffer concentration in the range from 5 to 100 mM by differential scanning calorimetry, circular dichroism, fluorescence, 1H NMR, and biological activity measurements. The thermal transitions are irreversible at high buffer concentrations at all pH values studied, although they are reversible between pH 3.5 and 5.4 at low buffer concentrations. The denaturation enthalpy, DeltaH(Tm), at denaturation temperature Tm was a function of both Tm and the buffer concentration, and this resulted in heat capacity changes decreasing with buffer concentration. When the denaturation enthalpies were corrected for Tm dependence, they did not appear to change versus pH. The denaturation entropies, however, appeared to decrease with pH, leading to a small but appreciable increase in the stability of the protein with pH. The difference between the number of moles of protons stoichiometrically bound to a mole of protein in the native and thermally denatured state, was calculated from the variation of Tm versus pH at each buffer concentration. The values obtained appear to depend on pH alone rather than upon temperature or buffer concentration, a result which agrees with the invariance of the denaturation enthalpies with pH. This dependence was fitted to the titration curve of a group with a pK of 5.4.

[Obtaining antibodies and development of an immunoassay for the detection of Escherichia coli proteins in preparations of human recombinant gamma interferon]. / Obtención de anticuerpos y desarrollo de un inmunoensayo para la detección de proteínas de Escherichia coli en preparaciones de interferón gamma humano recombinante.

The present paper refers to the obtainment of polyspecific antisera directed against Escherichia coli host strain used to produce recombinant human gamma interferon (rec. hum. gamma IFN). The antisera were obtained by the cascade immunization method. The animals (n = 3) were initially immunized with an E. coli protein preparation (EcPp) of the host strain obtained from a blank run which assures the absence of the rec. hum. gamma IFN protein. Afterwards, consecutive immunizations were carried out with the less immunogenic proteins. To obtain those proteins, EcPp is passed through a column containing antibodies purified from previous inoculations coupled to a gel matrix. In this way, the proteins that have not been recognized by the immune system in that moment (e.g. do not have their corresponding antibodies coupled to the column) are separated an used to reimmunize the animals. The analyses of the antisera by Western blotting show a progressive recognition of the host strain proteins by the antisera with the progression of the cascade method. The recognition is evident through all the molecular weight range. Those antisera were used as quality control of the recombinant protein, by quantification of the host strain protein contaminants using a multiantigenic ELISA. The detection limit of that system was 3.125 ng/mL and the quantification limit 6.25 ng/mL.

Obtención de anticuerpos y desarrollo de un inmunoensayo para la detección de proteínas de Escherichia coli en preparaciones de interferón Y humano recombinante / Obtainment of polyspecific antibodies against proteins of an Escherichia coli strain expressing human Y interferon and development of an immunoassay

Se describe la obtención de antisueros poliespecíficos dirigidos contra las proteínas de la cepa de Escherichia coli (W3110) empleada en la producción del interferón gamma humano recombinante (IFN gamma hum.rec.), por el método de inmunización en cascada. Para esto, 3 conejos fueron inmunizados inicialmente con una preparación de proteínas de E. coli (pPEc) obtenida a través de un proceso "en blanco" (proceso similar al realizado en la producción de la proteína recombinante, pero en ausencia de esta). Posteriormente se realizaron inmunizaciones sucesivas con las proteínas menos inmunogénicas, las cuales fueron obtenidas pasando la pPEc por una columna en la cual se encontraban acoplados anticuerpos purificados del suero de animales previamente inmunizados con la misma. Se demostró por "Western Blotting" que con este método se logró obtener antisueros de amplio espectro los cuales reconocen a la mayoría de las proteínas de la cepa huésped. Estos antisueros fueron empleados en el control de calidad de la proteína recombinante por medio de un ELISA de captura para la valoración de antígenos. El límite de detección fue de 3,125 ng/ml y el de cuantificación 6,25 ng/ml

Obtención de anticuerpos y desarrollo de un inmunoensayo para la detección de proteínas de Escherichia coli en preparaciones de interferón Y humano recombinante / Obtainment of polyspecific antibodies against proteins of an Escherichia coli strain expressing human Y interferon and development of an immunoassay

Se describe la obtención de antisueros poliespecíficos dirigidos contra las proteínas de la cepa de Escherichia coli (W3110) empleada en la producción del interferón gamma humano recombinante (IFN gamma hum.rec.), por el método de inmunización en cascada. Para esto, 3 conejos fueron inmunizados inicialmente con una preparación de proteínas de E. coli (pPEc) obtenida a través de un proceso "en blanco" (proceso similar al realizado en la producción de la proteína recombinante, pero en ausencia de esta). Posteriormente se realizaron inmunizaciones sucesivas con las proteínas menos inmunogénicas, las cuales fueron obtenidas pasando la pPEc por una columna en la cual se encontraban acoplados anticuerpos purificados del suero de animales previamente inmunizados con la misma. Se demostró por "Western Blotting" que con este método se logró obtener antisueros de amplio espectro los cuales reconocen a la mayoría de las proteínas de la cepa huésped. Estos antisueros fueron empleados en el control de calidad de la proteína recombinante por medio de un ELISA de captura para la valoración de antígenos. El límite de detección fue de 3,125 ng/ml y el de cuantificación 6,25 ng/ml (AU)