Primer design for the cloning of immunoglobulin heavy-chain leader-variable regions from mouse hybridoma cells using the PCR.

To facilitate the rapid cloning and sequencing of rearranged murine heavy-chain variable regions, we have designed a set of universal primers using conserved sequences of leader (signal peptide), framework one and constant regions of the immunoglobulin heavy-chain genes. RNA was extracted from the mouse hybridoma cells secreting monoclonal antibodies: IOR-T3 (anti-CD3), C6 (anti-P1 of N. meningitidis B385), IOR-T1 (anti-CD6), CB-CEA.1 (anti-carcinoembryonic antigen), CB-Fib.1 (anti-human fibrin) and CB-Hep.2 (anti-hepatitis B surface antigen). First-strand cDNA was synthesized and amplified using PCR. The primers successfully amplified correct size fragments from cDNA prepared from all hybridomas. These methods will facilitate the cloning and sequencing of mouse immunoglobulin variable regions.

Specific amplification of rearranged immunoglobulin variable region genes from mouse hybridoma cells.

In this article we show how the polymerase chain reaction (PCR) and primers designed for conserved sequences of leader (L), framework one (FR1) and constant (CONST) regions of immunoglobulin light and heavy chain genes can be used for the cloning and sequencing of rearranged antibody variable regions from mouse hybridoma cells. RNA was extracted from the mouse hybridoma cells secreting MAbs: IOR-T3a (anti-CD3), C6 (anti-P1 of N. meningitidis B385), IOR-T1 (anti-CD6), CB-CEA.1 (anti-carcinoembryonic antigen), and CB-Fib.1 (anti-human fibrin). First strand cDNA was synthesized and amplified using PCR. The newly designed primers are superior to others reported recently in the literature. Isolated PCR DNA fragments of C6 and IOR-T3a were sequenced after asymmetric amplification, or M13 cloning. The FR1/CONST primer combinations selectively amplified mouse lights chain of groups kappa II, V, and VI, and heavy chains of groups IIa and IIc. The L/CONST primers for light chains amplified light chains from all four hybridomas. These methods greatly facilitate structural and functional studies of antibodies by reducing the efforts required to clone and sequence their variable regions.

Serologic and molecular characterization of a human monoclonal rheumatoid factor derived from rheumatoid synovial cells.

Molecular characterization of rheumatoid factors (RF) in rheumatoid arthritis (RA) has been hampered because of their polyclonality. To overcome this problem, we generated monoclonal RF-secreting hybridomas from rheumatoid synovial cells. Among the RF-secreting hybridomas, HAF10 secreted an IgM-RF that was monospecific for human IgG. It bound well to IgG1 and IgG2, but not to IgG3 and IgG4. Sequence analysis of its heavy and light chains showed that it contained a VH1 heavy chain and a V lambda light chain that did not belong to any known lambda light chain subgroup, and therefore, probably represented a new lambda subgroup. These results indicated that both the heavy and light chains of a monoclonal IgM-RF from rheumatoid synovial cells were quite different from the reported variable region sequences of several monoclonal RF derived mainly from patients with mixed cryoglobulinemia. Further studies of additional monoclonal RF from RA patients are warranted to define precisely their genetic basis and to further our understanding of the immunopathology of RA.

Immunoglobulin V regions of a bactericidal anti-Neisseria meningitidis outer membrane protein monoclonal antibody.

C6 is a potentially therapeutic murine monoclonal antibody that recognizes the class 1 outer membrane protein of Neisseria meningitidis. C6 specifically immunoblots this antigen and augments in vitro killing of N. meningitidis bacteria. We describe a general method of obtaining the heavy and light chain variable-region sequence from immunoglobulin-secreting cells. The method uses mixed polymerase chain reaction (PCR) primers designed from the 5' end of the framework 1 (FR1) sequences of the heavy and light chains, and 3'-end primers for constant-region conserved sequences. The method has been applied to the cloning and sequencing of the variable region of C6 to construct a humanized monoclonal antibody. Rapid amplification and sequencing of variable regions by this general method have multiple applications in the study of the immune response to infectious diseases.

Evaluación de diferentes condiciones de cultivo del hibridoma IFI/B6/C5 para su propagación in vitro y la producción de anticuerpos monoclonales / Evaluation of different culture conditions for the in vitro propagation of the hybridoma IFI/B6/C5, and the production of monoclonal antibodies

Las cantidades y la pureza requeridas para los anticuerpos monoclonales (AvM), con vistas a satisfacer su demanda mundial, han conducido al desarrollo de las técnicas para la propagación masiva in vitro de los hibridomas, y su purificación a partir de los sobrenadantes de cultivo, como una alternativa ventajosa con respecto a su producción convencional en animales. Como paso previo para abordar el cultivo masivo, nosotros hemos estudiado el crecimiento y producción de inmunoglobulinas del hibridoma IFI/B6/C5, secretor de AcM contra el IFN * humano recombinante, bajo diferentes condiciones de cultivo y en distintas formulaciones de medio. Se demostró que la combinación: 2

de suero bovino y 3

de sobrenadante de células endoteliales humanas (HECS), como aditivo al medio base RPMI1640 suplementado, es comparable, e incluso mejor, que el 10

de suero bovino, la mezcla insulina-transferrina-etanolamina-selenio (ITES), y 2

de suero bovino más ITES, tanto para el crecimiento estacionario, como en botellas roller, y la producción de inmunoglobulinas monoclonales. Por otra parte, se demostró que los cultivos roller, sometidos a un sistema de renovación parcial del medio, con reposición celular, permiten alcanzar densidades celulares superiores, y concentraciones mayores de inmunoglobulinas.

Inmunización primaria in vitro de linfocitos de ratón para la obtención de hibridomas B / In vitro primary immunization of mouse lymphocytes for the obtention of B hybridomas

Las células esplénicas de ratones BALB/c se sometieron a un proceso de inmunización primaria en cultivo, empleando como antígeno el factor de crecimiento epidérmico humano recombinante, y el sobrenadante de cultivos mixtos de timocitos de ratón como fuente estimuladora de activación y progresión. En algunos experimentos se evaluó el efecto del sobrenadante de células endoteliales humanas (HECS) durante el período de inmunización. Las células inmunizadas se hibridizaron con el mieloma P3/x63-Ag8-653 para obtener hibridomas. Por microscopía electrónica de trasmisión se siguieron los cambios morfológicos de los linfocitos durante los cinco días de inmunización in vitro, siendo estos característicos de la transformación de células quiescentes en altamente secretoras. Se demostró que la secreción de anticuerpo específico durante el período de inmunización no podía ser evaluada mediante un sistema ELISA con el antígeno, a causa de la gran reactividad cruzada inespecífica de IgM policlonales. El HECS estimuló, tanto la frecuencia de hibridización como la formación de hibridomas específicos. Se incluyó una batería de antígenos no relacionados durante el ensayo de los sobrenadantes de los hibridomas, con vistas a descartar las células secretoras de IgM de amplia reactividad cruzada. Todos los hibridomas específicos producían anticuerpos del tipo IgM.

Inmunización primaria in vitro de linfocitos de ratón para la obtención de hibridomas B / In vitro primary immunization of mouse lymphocytes for the obtention of B hybridomas

Las células esplénicas de ratones BALB/c se sometieron a un proceso de inmunización primaria en cultivo, empleando como antígeno el factor de crecimiento epidérmico humano recombinante, y el sobrenadante de cultivos mixtos de timocitos de ratón como fuente estimuladora de activación y progresión. En algunos experimentos se evaluó el efecto del sobrenadante de células endoteliales humanas (HECS) durante el período de inmunización. Las células inmunizadas se hibridizaron con el mieloma P3/x63-Ag8-653 para obtener hibridomas. Por microscopía electrónica de trasmisión se siguieron los cambios morfológicos de los linfocitos durante los cinco días de inmunización in vitro, siendo estos característicos de la transformación de células quiescentes en altamente secretoras. Se demostró que la secreción de anticuerpo específico durante el período de inmunización no podía ser evaluada mediante un sistema ELISA con el antígeno, a causa de la gran reactividad cruzada inespecífica de IgM policlonales. El HECS estimuló, tanto la frecuencia de hibridización como la formación de hibridomas específicos. Se incluyó una batería de antígenos no relacionados durante el ensayo de los sobrenadantes de los hibridomas, con vistas a descartar las células secretoras de IgM de amplia reactividad cruzada. Todos los hibridomas específicos producían anticuerpos del tipo IgM.

Evaluación de diferentes condiciones de cultivo del hibridoma IFI/B6/C5 para su propagación in vitro y la producción de anticuerpos monoclonales / Evaluation of different culture conditions for the in vitro propagation of the hybridoma IFI/B6/C5, and the production of monoclonal antibodies

Las cantidades y la pureza requeridas para los anticuerpos monoclonales (AvM), con vistas a satisfacer su demanda mundial, han conducido al desarrollo de las técnicas para la propagación masiva in vitro de los hibridomas, y su purificación a partir de los sobrenadantes de cultivo, como una alternativa ventajosa con respecto a su producción convencional en animales. Como paso previo para abordar el cultivo masivo, nosotros hemos estudiado el crecimiento y producción de inmunoglobulinas del hibridoma IFI/B6/C5, secretor de AcM contra el IFN * humano recombinante, bajo diferentes condiciones de cultivo y en distintas formulaciones de medio. Se demostró que la combinación: 2% de suero bovino y 3% de sobrenadante de células endoteliales humanas (HECS), como aditivo al medio base RPMI1640 suplementado, es comparable, e incluso mejor, que el 10% de suero bovino, la mezcla insulina-transferrina-etanolamina-selenio (ITES), y 2% de suero bovino más ITES, tanto para el crecimiento estacionario, como en botellas roller, y la producción de inmunoglobulinas monoclonales. Por otra parte, se demostró que los cultivos roller, sometidos a un sistema de renovación parcial del medio, con reposición celular, permiten alcanzar densidades celulares superiores, y concentraciones mayores de inmunoglobulinas.

Obtención de hibridomas de ratón productores de anticuerpos monoclonales que reconocen células humanas de origen T, III:Determinación del reconocimiento ultraestructural de los anticuerpos monoclonales IOR-T1 e IOR-T2 / Obtention of mice hybridomas producing monoclonal antibodies which recognize human T cell: determination of ultrastructural recognition of IOR-T1 and IOR-T2 monoclonal antibodies

La combinación de métodos inmunológicos y ultraestructurales constituye un elemento fundamental para la identificación de las características del reconocimiento celular de los anticuerpos monoclonales. En el presente artículo se reporta la aplicación de la técnica de inmunoperoxidasa para microscopia electrónica, en la dilucidación del reconocimiento celular y la ubicación de las estructuras antigénicas identificadas por los anticuerpos monoclonales IOR-T1 e IOR-T2, utilizando como sustrato antigénico células mononucleares de sangre periférica de individuos normales y de pacientes con linfomas T cutáneos. Se determinó que el IOR-T1 reconoce un marcador de superficie celular característicos de los linfocito humanos T normales, que puede ser expresado también por células tumorales del mismo origen. El IOR-T2 identifica exclusivamente una parte de la población tumoral celular con características morfológicas compatibles con las células de Sézary, provenientes de la sangre periférica de dos pacientes con linfomas T cutáneos

Obtención de hibridomas de ratón productores de anticuerpos monoclonales que reconocen células humanas de origen T, III:Determinación del reconocimiento ultraestructural de los anticuerpos monoclonales IOR-T1 e IOR-T2 / Obtention of mice hybridomas producing monoclonal antibodies which recognize human T cell: determination of ultrastructural recognition of IOR-T1 and IOR-T2 monoclonal antibodies

La combinación de métodos inmunológicos y ultraestructurales constituye un elemento fundamental para la identificación de las características del reconocimiento celular de los anticuerpos monoclonales. En el presente artículo se reporta la aplicación de la técnica de inmunoperoxidasa para microscopia electrónica, en la dilucidación del reconocimiento celular y la ubicación de las estructuras antigénicas identificadas por los anticuerpos monoclonales IOR-T1 e IOR-T2, utilizando como sustrato antigénico células mononucleares de sangre periférica de individuos normales y de pacientes con linfomas T cutáneos. Se determinó que el IOR-T1 reconoce un marcador de superficie celular característicos de los linfocito humanos T normales, que puede ser expresado también por células tumorales del mismo origen. El IOR-T2 identifica exclusivamente una parte de la población tumoral celular con características morfológicas compatibles con las células de Sézary, provenientes de la sangre periférica de dos pacientes con linfomas T cutáneos

Pattern of organ colonization of metastasizing mouse L929-MM4 cells and the stimulation of lung tumor formation by cyclophosphamide.

The pattern of lung colonization of L929-MM4 metastasis-derived cells was studied in C3HA/Hab mice. The incidence of mice with lung tumors and the number of tumor foci increased with the number of tumor cells in the i.v. inoculum until a 'plateau' was reached. However, some 30 per cent of the animals continued to show no macroscopic or microscopic evidence of metastases. Twenty days after the i.v. injection of 2.5 X 10(5) L929-MM4 cells, viable tumor cells were recovered from 80-90 per cent of the animals as judged by in vivo or in vitro assay methods, even though survival of mice under these conditions was 50 per cent at the end of a 3-month period. These results are discussed in relation to possible tumor dormant states. Cyclophosphamide stimulated both the incidence and the number of lung tumor foci after i.v. injection of tumor cells, if the drug was administered before the tumor cell inoculum. On the basis of the observed time dependency of this effect, and the low immunogenicity of L929-MM4 cells in C3HA/Hab mice, the results could be explained on the basis of drug damage to normal cells.