Multi-Locus sequence typing of Treponema pallidum in male patients with genital ulcers in a public STD clinic in South Brazil: a new allele and almost complete macrolide resistance / Tipificación de Treponema pallidum mediante MLST en pacientes masculinos con úlceras genitales en una clínica pública de ETS en el sur de Brasil: un nuevo alelo y resistencia casi completa a los macrólidos. / Tipagem do Treponema pallidum por MLST em pacientes do sexo masculino com úlceras genitais em uma clínica pública de DST no Sul do Brasil: um novo alelo e resistência quase completa aos macrolídeos

Objective: Considering the lack of data on T. pallidum genotyping in Brazil, we aimed to study its strains and their resistance to macrolides in genital ulcers suggestive of syphilis.Methods: Men with genital ulcers suggestive of syphilis were invited to participate. Samples were collected with a dry cotton swab and immersed in a 0.9% NaCl solution. Detection was done by PCR amplification of 260 bp of the tpp47 gene. The PCR product was analyzed by electrophoresis in a 2% agarose gel containing 0.05% ethidium bromide. Positive PCR samples were analyzed by MLST (sequencing of chromosomal loci TP0136, TP0548, and TP0705). The A2058G and A2059G mutations in the 23S rRNA gene were evaluated by nested PCR. DNA sequencing was analyzed using Bioedit software (Tom Hall, USA). Genotyping was performed using the PubMLST online platform (Grillová scheme). Results: All subjects were residents of Porto Alegre and aged between 19 and 66 years. Of the 43 samples, 32 were positive for PCR for T. pallidum. Thirty strains were available for genotyping and belonged to the SS14-like (73.3%) or Nicholslike (20%) Clonal Complex. Three complete MLST profiles were identified (1.3.1; 9.7.3 and 28.7.3), and a new allele was identified in one sample (approved by pubMLST curators as TP0705-22). Only one sample did not present the 2058 mutation in the 23S rRNA gene.Conclusion: Our study identified genetic diversity in T. pallidum DNA using MLST with allelic variants for TP0136, TP0548, and TP0705, including a new allele. A single sample was characterized as genotypically susceptible to macrolides. All other samples (more than 95%) presented the A2058G mutation in the 23S rRNA gene, which causes resistance to macrolides. Improving understanding of the local epidemiology of T. pallidum with representative samples that allow cofactor analysis is crucial for prevention and care.

Objetivo: Considerando la falta de datos sobre el genotipado de T. pallidum en Brasil, nos propusimos estudiar sus cepas y su resistencia a macrólidos en úlceras genitales sugestivas de sífilis. Métodos: Se invitó a participar a hombres con úlceras genitales sugestivas de sífilis. Las muestras se recogieron con un hisopo de algodón seco y se sumergieron en una solución de NaCl al 0,9%. La detección se realizó mediante amplificación por PCR de 260 pb del gen tpp47. El producto de la PCR se analizó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2% que contenía bromuro de etidio al 0,05%. Las muestras de PCR positivas se analizaron mediante MLST (secuenciación de los loci cromosómicos TP0136, TP0548 y TP0705). Las mutaciones A2058G y A2059G en el gen 23S rRNA se evaluaron mediante PCR anidada. La secuenciación de ADN se analizó utilizando el software Bioedit (Tom Hall, EE. UU.). El genotipado se realizó utilizando la plataforma en línea PubMLST (esquema Grillová). Resultados: Todos los sujetos eran residentes de Porto Alegre y tenían edades comprendidas entre 19 y 66 años. De las 43 muestras, 32 resultaron positivas a la PCR para T. pallidum. Treinta cepas estaban disponibles para el genotipado y pertenecían al Complejo Clonal tipo SS14 (73,3%) o tipo Nichols (20%). Se identificaron tres perfiles MLST completos (1.3.1; 9.7.3 y 28.7.3) y se identificó un nuevo alelo en una muestra (aprobado por los curadores de pubMLST como TP0705-22). Sólo una muestra no presentó la mutación 2058 en el gen 23S rRNA. Conclusión: Nuestro estudio identificó diversidad genética en el ADN de T. pallidum utilizando MLST con variantes alélicas para TP0136, TP0548 y TP0705, incluido un nuevo alelo. Una sola muestra se caracterizó como genotípicamente susceptible a macrólidos. El resto de muestras (más del 95%) presentaron la mutación A2058G en el gen 23S rRNA, que provoca resistencia a los macrólidos. Mejorar la comprensión de la epidemiología local de T. pallidum con muestras representativas que permitan el análisis de cofactores es crucial para la prevención y la atención.

Objetivo: Considerando a ausência de dados sobre genotipagem de T. pallidum no Brasil, objetivamos estudar suas cepas e sua resistência aos macrolídeos em úlceras genitais sugestivas de sífilis.Métodos: Foram convidados a participar homens com úlceras genitais sugestivas de sífilis. As amostras foram coletadas com swab de algodão seco e imersas em solução de NaCl 0,9%. A detecção foi feita por amplificação por PCR de 260 pb do gene tpp47. O produto de PCR foi analisado por eletroforese em gel de agarose a 2% contendo brometo de etídio a 0,05%. Amostras de PCR positivas foram analisadas por MLST (sequenciamento dos loci cromossômicos TP0136, TP0548 e TP0705). As mutações A2058G e A2059G no gene 23S rRNA foram avaliadas por nested PCR. O sequenciamento de DNA foi analisado utilizando o software Bioedit (Tom Hall, EUA). A genotipagem foi realizada utilizando a plataforma online PubMLST (esquema Grillová).Resultados: Todos os sujeitos eram residentes de Porto Alegre e tinham idade entre 19 e 66 anos. Das 43 amostras, 32 foram positivas para PCR para T. pallidum. Trinta cepas estavam disponíveis para genotipagem e pertenciam ao Complexo Clonal SS14-like (73,3%) ou Nichols-like (20%). Três perfis completos de MLST foram identificados (1.3.1; 9.7.3 e 28.7.3), e um novo alelo foi identificado em uma amostra (aprovado pelos curadores do pubMLST como TP0705-22). Apenas uma amostra não apresentava a mutação 2058 no gene 23S rRNA.Conclusão: Nosso estudo identificou diversidade genética no DNA de T. pallidum usando MLST com variantes alélicas para TP0136, TP0548 e TP0705, incluindo um novo alelo. Uma única amostra foi caracterizada como genotípicamente suscetível a macrolídeos. Todas as demais amostras (mais de 95%) apresentaram a mutação A2058G no gene 23S rRNA, que causa resistência aos macrolídeos. Melhorar a compreensão da epidemiologia local do T. pallidum com amostragens representativas que permitam análise de cofatores é crucial para a prevenção e o cuidado.

Analysis of DNA extraction methods for detection of Treponema pallidum: A comparison of three methods.

Syphilis is a sexually transmitted disease caused by Treponema pallidum. DNA amplification methods have started to be used to facilitate diagnosis at different stages of the disease. The success of such methodologies depends on obtaining DNA from clinical samples in adequate quantity and quality for molecular reactions. There are many DNA extraction kits, but often the molecular analysis process is unfeasible due to its cost and access to imported products. Thus, this study aimed to analyze three methods of extracting DNA from Treponema pallidum from ulcers of patients investigated for syphilis. The three methods, an in house one (sonication) and two commercial ones (LGC, Brazil) and the PureLink Genomic DNA Mini Kit (Thermo Fisher Scientific, USA) were compared to the sequencing of these samples, which were used as a reference. Each method was evaluated based on the detection of T. pallidum by PCR using the tpp47 gene as a target for amplification, DNA quantification and method execution time. When compared to the sequencing, the sensitivity and agreement of the PureLink, sonication and LGC methods to extracted DNA were 100% (K = 1.0), 96.5% (K = 0.96) and 72.4% (K = 0.694), respectively. Specificity was 100% with the three methods. The sonication method was the closest in concentration of DNA to the PureLink method with a similar degree of purity, besides having the lowest cost-benefit ratio. It can be an interesting option for laboratories that work with reduced costs, since it is much more financially viable.