Fish and seafood qualitative analysis using anti-histamine polyclonal antibodies / Produção de anticorpos policlonais contra histamina para análises qualitativas de peixes e frutos do mar

This paper had the objective to produce polyclonal antibodies against histamine, which is a biogenic amine produced by the histidin aminoacid decarboxilation. The qualitative analysis of histamine in commercialized fish and seafood is very important for human health, once the histamine presence is followed by cadaverine, spermidine and putrescine, all produced during the post-mortem process. Polyclonal antibodies were raised against histamine and used in PTA-ELISA tests (“plate trapped antigen – enzyme linked immunosorbent assay”) to evaluate the presence of histamine in frozen fish (“pescada”, cat fish, sardines, salmon, “manjuba”, tilapia fillets) and for seafood ( shrimp and common squid) during storage process. The antibodies showed sensibility up to 1 ng of histamine per gram of samples. Histamine appears as picks during the 50 hours of analysis, for the fish and seafood samples, maintained on the top of crushed ice. Bacterial growth was also determined, being identified 14 species transforming aminoacids on the samples surface during the process of analysis. ELISA showed to be an efficient and sensible test for the hitamine presence.

Este trabalho teve por objetivo a produção de anticorpos policlonais contra histamina, que é uma amina biogênica produzida pela decarboxilação do aminoácido histidina. A análise qualitativa e quantitativa da histamina em peixes e frutos do mar comercializados torna-se importante devido ao fato desta ser tóxica ao organismo humano quando coexistente com as aminas biogênicas cadaverina e putrescina, também produzidas por decarboxilação de aminoácidos no processo pós-mortem. Os anticorpos policlonais produzidos foram utilizados em ensaios do tipo PTA-ELISA (“plate trapped antigen – enzyme linked immunosorbent assay”) para avaliação da presença de histamina em peixes (pescada, tilápia, manjuba, sardinha, salmão e pintado) e em frutos do mar (lula e camarão) durante o processo de armazenamento. Os anticorpos mostraram sensibilidade na detecção de 1 ng de histamina por grama de amostra analisada. A histamina apresentou picos de liberação nos diferentes materiais analisados por 50 horas, mantidos sobre o gelo e foi também verificada a presença de 14 bactérias contaminando e degradando aminoácidos na superfície das amostras, ao longo do teste. O ELISA se mostrou bastante eficiente e sensível para determinação da presença de histamina nos alimentos.

Fish and seafood qualitative analysis using anti-histamine polyclonal antibodies / Produção de anticorpos policlonais contra histamina para análises qualitativas de peixes e frutos do mar

This paper had the objective to produce polyclonal antibodies against histamine, which is a biogenic amine produced by the histidin aminoacid decarboxilation. The qualitative analysis of histamine in commercialized fish and seafood is very important for human health, once the histamine presence is followed by cadaverine, spermidine and putrescine, all produced during the post-mortem process. Polyclonal antibodies were raised against histamine and used in PTA-ELISA tests (“plate trapped antigen enzyme linked immunosorbent assay”) to evaluate the presence of histamine in frozen fish (“pescada”, cat fish, sardines, salmon, “manjuba”, tilapia fillets) and for seafood ( shrimp and common squid) during storage process. The antibodies showed sensibility up to 1 ng of histamine per gram of samples. Histamine appears as picks during the 50 hours of analysis, for the fish and seafood samples, maintained on the top of crushed ice. Bacterial growth was also determined, being identified 14 species transforming aminoacids on the samples surface during the process of analysis. ELISA showed to be an efficient and sensible test for the hitamine presence.

Este trabalho teve por objetivo a produção de anticorpos policlonais contra histamina, que é uma amina biogênica produzida pela decarboxilação do aminoácido histidina. A análise qualitativa e quantitativa da histamina em peixes e frutos do mar comercializados torna-se importante devido ao fato desta ser tóxica ao organismo humano quando coexistente com as aminas biogênicas cadaverina e putrescina, também produzidas por decarboxilação de aminoácidos no processo pós-mortem. Os anticorpos policlonais produzidos foram utilizados em ensaios do tipo PTA-ELISA (“plate trapped antigen enzyme linked immunosorbent assay”) para avaliação da presença de histamina em peixes (pescada, tilápia, manjuba, sardinha, salmão e pintado) e em frutos do mar (lula e camarão) durante o processo de armazenamento. Os anticorpos mostraram sensibilidade na detecção de 1 ng de histamina por grama de amostra analisada. A histamina apresentou picos de liberação nos diferentes materiais analisados por 50 horas, mantidos sobre o gelo e foi também verificada a presença de 14 bactérias contaminando e degradando aminoácidos na superfície das amostras, ao longo do teste. O ELISA se mostrou bastante eficiente e sensível para determinação da presença de histamina nos alimentos.

Immunoassays and Zootechny: Pratical approaches / Imunoensaios e Zootecnia: Aplicações práticas

For decades, immunoassays have been improved and nowadays its technology offers a wide variety of methodologies, based upon antigen-antibody system, from latex agglutination to Biosensors. This revision brings up in a short term, different applications for immunoassays in zootechny exploitation. Examples of immunoassays use in different situations, as vegetal or animal areas are exposed in this work, opening new possibilities to research in agriculture, pastures and livestock.

Durante décadas, técnicas imunológicas têm sido aperfeiçoadas no sentido de contribuir para o desenvolvimento da pesquisa, principalmente na forma de diagnóstico de doenças e na produção de vacinas. Os imunoensaios apresentam hoje um grande número de tecnologias e métodos, baseados na reação antígeno-anticorpo, que vão desde ensaios de aglutinação até uso de biosensores. Esta revisão traz de forma resumida as diversas aplicações dos imunoensaios na exploração zootécnica. Exemplos de aplicação comercial destes imunoensaios podem ser visualizados nas diferentes áreas de atuação do profissional da área de zootecnia, seja animal ou vegetal e estão expostos neste trabalho de forma a disponibilizar novas possibilidades de aplicação na agropecuária.

Immunoassays and Zootechny: Pratical approaches / Imunoensaios e Zootecnia: Aplicações práticas

For decades, immunoassays have been improved and nowadays its technology offers a wide variety of methodologies, based upon antigen-antibody system, from latex agglutination to Biosensors. This revision brings up in a short term, different applications for immunoassays in zootechny exploitation. Examples of immunoassays use in different situations, as vegetal or animal areas are exposed in this work, opening new possibilities to research in agriculture, pastures and livestock.

Durante décadas, técnicas imunológicas têm sido aperfeiçoadas no sentido de contribuir para o desenvolvimento da pesquisa, principalmente na forma de diagnóstico de doenças e na produção de vacinas. Os imunoensaios apresentam hoje um grande número de tecnologias e métodos, baseados na reação antígeno-anticorpo, que vão desde ensaios de aglutinação até uso de biosensores. Esta revisão traz de forma resumida as diversas aplicações dos imunoensaios na exploração zootécnica. Exemplos de aplicação comercial destes imunoensaios podem ser visualizados nas diferentes áreas de atuação do profissional da área de zootecnia, seja animal ou vegetal e estão expostos neste trabalho de forma a disponibilizar novas possibilidades de aplicação na agropecuária.

Fermentation and epiphytic microflora dynamics in sugar cane silage

Sugar cane silages are characterized by extensive yeast activity, alcohol production and great dry matter - DM - losses. Better knowledge of the fermentation process is fundamental to the development of efficient ensilage techniques for this forage. This study evaluates temporal changes in chemical composition, DM losses and epiphytic microflora in sugar cane silage. Mature sugar cane, variety RB835486 (12 months of vegetative growth), was hand harvested, processed in a stationary chopper and ensiled in 20-L plastic buckets provided with valves for gas release and a device for effluent collection. Laboratory silos were kept at ambient temperature and sampled after ½, 1, 2, 3, 7, 15, 45, 90, 120 and 180 days. Ethanol concentration reached 6.4% in DM after 15 days of ensilage, followed by 71% water soluble carbohydrates - WSCs - disappearance. Gas and total DM losses reached a plateau on day 45 (16% and 29% of DM, respectively). Yeast count was higher on the second day (5.05 log cfu g-1). Silage pH declined to below 4.0 on the third day. Effluent yield was negligible (20 kg t-1). DM content in the forage decreased (35% to 26%) from day 0 to day 45. The increase in ethanol concentration showed an opposite trend to WSCs and true in vitro dry matter digestibility reductions in the silage. Developing methods to control yeasts, most probably through the use of additives, will enable more efficient production of sugar cane silage by farmers.

Silagens de cana-de-açúcar caracterizam-se pela extensa atividade de leveduras, alto teor de álcool e grandes perdas de matéria seca - MS. Conhecer melhor o processo fermentativo é fundamental para o desenvolvimento de técnicas eficientes de ensilagem da cana. Este trabalho avalia a mudança temporal na composição química, nas perdas de MS e na microflora epífita nestas silagens. Cana-de-açúcar (RB835486) foi colhida manualmente (12 meses de crescimento), picada em picadora estacionária e ensilada em baldes de plástico de 20 L com válvulas para gases e aparato para colheita de efluentes. Os silos laboratoriais foram mantidos sob temperatura ambiente e amostrados após ½, 1, 2, 3, 7, 15, 45, 90, 120 e 180 dias. Etanol atingiu 6,4% na MS no 15º dia após ensilagem, seguido pelo desaparecimento de 71% dos carboidratos solúveis - CHOs. As perdas gasosas e a perda total de MS estabilizaram-se após 45 dias (16% e 29% da MS). A contagem de leveduras foi máxima no segundo dia (5,05 log ufc g-1). O pH atingiu nível abaixo de 4,0 no terceiro dia. A produção de efluentes foi insignificante (20,1 kg t-1). O teor de MS da forragem decresceu (35% para 26%) do dia 0 ao 45º dia. O padrão de variação na concentração de etanol foi inverso à concentração de CHOs e à redução da digestibilidade da silagem. O desenvolvimento de métodos de controle das leveduras, provavelmente com o uso de aditivos, melhorará a eficiência no uso de silagens de cana-de-açúcar pelos pecuaristas.

Fermentation and epiphytic microflora dynamics in sugar cane silage

Sugar cane silages are characterized by extensive yeast activity, alcohol production and great dry matter - DM - losses. Better knowledge of the fermentation process is fundamental to the development of efficient ensilage techniques for this forage. This study evaluates temporal changes in chemical composition, DM losses and epiphytic microflora in sugar cane silage. Mature sugar cane, variety RB835486 (12 months of vegetative growth), was hand harvested, processed in a stationary chopper and ensiled in 20-L plastic buckets provided with valves for gas release and a device for effluent collection. Laboratory silos were kept at ambient temperature and sampled after ½, 1, 2, 3, 7, 15, 45, 90, 120 and 180 days. Ethanol concentration reached 6.4% in DM after 15 days of ensilage, followed by 71% water soluble carbohydrates - WSCs - disappearance. Gas and total DM losses reached a plateau on day 45 (16% and 29% of DM, respectively). Yeast count was higher on the second day (5.05 log cfu g-1). Silage pH declined to below 4.0 on the third day. Effluent yield was negligible (20 kg t-1). DM content in the forage decreased (35% to 26%) from day 0 to day 45. The increase in ethanol concentration showed an opposite trend to WSCs and true in vitro dry matter digestibility reductions in the silage. Developing methods to control yeasts, most probably through the use of additives, will enable more efficient production of sugar cane silage by farmers.

Silagens de cana-de-açúcar caracterizam-se pela extensa atividade de leveduras, alto teor de álcool e grandes perdas de matéria seca - MS. Conhecer melhor o processo fermentativo é fundamental para o desenvolvimento de técnicas eficientes de ensilagem da cana. Este trabalho avalia a mudança temporal na composição química, nas perdas de MS e na microflora epífita nestas silagens. Cana-de-açúcar (RB835486) foi colhida manualmente (12 meses de crescimento), picada em picadora estacionária e ensilada em baldes de plástico de 20 L com válvulas para gases e aparato para colheita de efluentes. Os silos laboratoriais foram mantidos sob temperatura ambiente e amostrados após ½, 1, 2, 3, 7, 15, 45, 90, 120 e 180 dias. Etanol atingiu 6,4% na MS no 15º dia após ensilagem, seguido pelo desaparecimento de 71% dos carboidratos solúveis - CHOs. As perdas gasosas e a perda total de MS estabilizaram-se após 45 dias (16% e 29% da MS). A contagem de leveduras foi máxima no segundo dia (5,05 log ufc g-1). O pH atingiu nível abaixo de 4,0 no terceiro dia. A produção de efluentes foi insignificante (20,1 kg t-1). O teor de MS da forragem decresceu (35% para 26%) do dia 0 ao 45º dia. O padrão de variação na concentração de etanol foi inverso à concentração de CHOs e à redução da digestibilidade da silagem. O desenvolvimento de métodos de controle das leveduras, provavelmente com o uso de aditivos, melhorará a eficiência no uso de silagens de cana-de-açúcar pelos pecuaristas.

SDS-Page and numerical analysis of Candida albicans from human oral cavity and other anatomical sites

The aim of the present research was to evaluate the protein polymorphism degrees among forty-eight C. albicans isolates from fourteen anatomical sites of clinical patients by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and numerical analyzes, in order to identify subspecies and their similarities in some infectious niches. Cell cultures were grown in YEPD medium, collected by centrifugation, and washed in cold saline solution. The whole-cell proteins were extracted by cell disruption using glass beads and submitted to SDS-PAGE technique. After electrophoresis, the protein bands were stained with coomassie-blue and analyzed by statistics package NTSYS-pc version 1.70 software. Similarity matrixes and dendrograms were generated by application of similarity coefficient of simple matching and UPGMA algorithm, respectively. The results obtained showed several C. albicans subtypes and their similarity degrees (80% to 100%). Such data showed that same patients may be infected by two or more C. albicans subtypes in certain anatomical sites (i.e. only in oral cavity of immunocompromised patients, blood, or tracheal secretion), or yet, two or more patients can be infected in identical anatomical sites (i.e. bronchial washing, urine, oral cavity, tracheal secretion, vaginal secretion, and healthy saliva) with a same C. albicans subtype. However, two or more patients also can show infections in corresponding sites (i.e. oral cavity of immunocompromised patients, blood, oropharyngeal secretion, oral cavity, tracheal secretion, vaginal secretion, and healthy saliva) by different C. albicans subtypes. Besides, two or more patients also can be infected with identical or different C. albicans subtypes in different anatomical sites (i.e.1. identical subtypes in vaginal secretion, tracheal secretion, and urine; abdominal secretion and spittle; drainage and oral cavity; catheter and healthy saliva - i.e.2. subtypes different in bronchial washing, oropharyngeal secretion, pulmonary secretion, oral cavity of immunocompromised patients, and blood). Complementary studies involving C. albicans sample isolated from several anatomical sites of immunocompetent or immunocompromised patients (before, during and after specifics therapies) and their families or hospital workers must be done in order to establish the sources of C. albicans colonization. The whole-cell proteins profile performed by SDS-PAGE associated with computer-assisted numerical analysis may provide preliminary criteria for taxonomic and epidemiological studies of such microorganisms.

O objetivo da presente pesquisa foi analisar os graus de polimorfismos protéicos entre isolados de C. albicans provenientes de diversos sítios anatômicos de quarenta e dois pacientes clínicos, através do emprego da eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e análise numérica, a fim de se identificar subespécies e suas similaridades nos diversos nichos infecciosos. Culturas celulares foram desenvolvidas em meio YEPD, coletadas por centrifugação e lavadas com solução salina gelada. As proteínas celulares totais, foram extraídas por rompimento celular, usando pérolas de vidro e submetidas à técnica de SDS-PAGE. Após a eletroforese, as bandas de proteínas foram coradas com coomassie-blue e analisadas pelo conjunto de programas estatístico NTSYS-pc versão 1,70. Matrizes de similaridade e dendrogramas foram gerados pela aplicação do coeficiente de similaridade simple-matching e do algoritmo UPGMA, respectivamente. Os resultados obtidos revelaram vários subtipos de C. albicans e seus graus de similaridade (80% a 100%). Tais dados permitiram demonstrar que, certos pacientes podem estar infectados com dois ou mais subtipos de C. albicans em determinados sítios anatômicos (i.e. apenas na cavidade oral de pacientes imunocomprometidos, sangue ou secreção traqueal), ou ainda, dois ou mais pacientes podem estar infectados em sítios anatômicos idênticos (i.e. apenas em lavagem brônquica, urina, cavidade oral, secreção traqueal, secreção vaginal ou saliva saudável) com um mesmo subtipo de C. albicans. No entanto, dois ou mais pacientes também podem apresentar infecções em sítios correspondentes (i.e. apenas na cavidade oral de pacientes imunocomprometidos, sangue, secreção orofaríngea, cavidade oral, secreção traqueal, secreção vaginal e saliva saudável) por diferentes subtipos de C. albicans. Além disso, dois ou mais pacientes também podem estar infectados com subtipos idênticos ou não de C. albicans em diferentes sítios anatômicos (i.e.1. idênticos subtipos na secreção vaginal, secreção traqueal e urina; secreção abdominal e escarro; drenagem e cavidade oral; cateter e saliva saudável - i.e.2. diferentes subtipos em lavagem brônquica, secreção orofaríngea, secreção pulmonar, cavidade oral de pacientes imunocomprometidos e sangue). Dados complementares envolvendo amostras de C. albicans isoladas de vários sítios anatômicos de pacientes imunocompetentes ou imunocomprometidos (antes, durante e após terapias específicas) e seus familiares ou trabalhadores hospitalares, deverão ser obtidos a fim de se estabelecer as possíveis fontes de colonização por esses microrganismos. De modo geral, os perfis de proteínas totais obtidos por SDS-PAGE associados com análise numérica computadorizada, permitem a obtenção de critérios adicionais para os estudos epidemiológicos e taxonômicos de C. albicans.

SDS-Page and numerical analysis of Candida albicans from human oral cavity and other anatomical sites

The aim of the present research was to evaluate the protein polymorphism degrees among forty-eight C. albicans isolates from fourteen anatomical sites of clinical patients by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and numerical analyzes, in order to identify subspecies and their similarities in some infectious niches. Cell cultures were grown in YEPD medium, collected by centrifugation, and washed in cold saline solution. The whole-cell proteins were extracted by cell disruption using glass beads and submitted to SDS-PAGE technique. After electrophoresis, the protein bands were stained with coomassie-blue and analyzed by statistics package NTSYS-pc version 1.70 software. Similarity matrixes and dendrograms were generated by application of similarity coefficient of simple matching and UPGMA algorithm, respectively. The results obtained showed several C. albicans subtypes and their similarity degrees (80% to 100%). Such data showed that same patients may be infected by two or more C. albicans subtypes in certain anatomical sites (i.e. only in oral cavity of immunocompromised patients, blood, or tracheal secretion), or yet, two or more patients can be infected in identical anatomical sites (i.e. bronchial washing, urine, oral cavity, tracheal secretion, vaginal secretion, and healthy saliva) with a same C. albicans subtype. However, two or more patients also can show infections in corresponding sites (i.e. oral cavity of immunocompromised patients, blood, oropharyngeal secretion, oral cavity, tracheal secretion, vaginal secretion, and healthy saliva) by different C. albicans subtypes. Besides, two or more patients also can be infected with identical or different C. albicans subtypes in different anatomical sites (i.e.1. identical subtypes in vaginal secretion, tracheal secretion, and urine; abdominal secretion and spittle; drainage and oral cavity; catheter and healthy saliva - i.e.2. subtypes different in bronchial washing, oropharyngeal secretion, pulmonary secretion, oral cavity of immunocompromised patients, and blood). Complementary studies involving C. albicans sample isolated from several anatomical sites of immunocompetent or immunocompromised patients (before, during and after specifics therapies) and their families or hospital workers must be done in order to establish the sources of C. albicans colonization. The whole-cell proteins profile performed by SDS-PAGE associated with computer-assisted numerical analysis may provide preliminary criteria for taxonomic and epidemiological studies of such microorganisms.

O objetivo da presente pesquisa foi analisar os graus de polimorfismos protéicos entre isolados de C. albicans provenientes de diversos sítios anatômicos de quarenta e dois pacientes clínicos, através do emprego da eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e análise numérica, a fim de se identificar subespécies e suas similaridades nos diversos nichos infecciosos. Culturas celulares foram desenvolvidas em meio YEPD, coletadas por centrifugação e lavadas com solução salina gelada. As proteínas celulares totais, foram extraídas por rompimento celular, usando pérolas de vidro e submetidas à técnica de SDS-PAGE. Após a eletroforese, as bandas de proteínas foram coradas com coomassie-blue e analisadas pelo conjunto de programas estatístico NTSYS-pc versão 1,70. Matrizes de similaridade e dendrogramas foram gerados pela aplicação do coeficiente de similaridade simple-matching e do algoritmo UPGMA, respectivamente. Os resultados obtidos revelaram vários subtipos de C. albicans e seus graus de similaridade (80% a 100%). Tais dados permitiram demonstrar que, certos pacientes podem estar infectados com dois ou mais subtipos de C. albicans em determinados sítios anatômicos (i.e. apenas na cavidade oral de pacientes imunocomprometidos, sangue ou secreção traqueal), ou ainda, dois ou mais pacientes podem estar infectados em sítios anatômicos idênticos (i.e. apenas em lavagem brônquica, urina, cavidade oral, secreção traqueal, secreção vaginal ou saliva saudável) com um mesmo subtipo de C. albicans. No entanto, dois ou mais pacientes também podem apresentar infecções em sítios correspondentes (i.e. apenas na cavidade oral de pacientes imunocomprometidos, sangue, secreção orofaríngea, cavidade oral, secreção traqueal, secreção vaginal e saliva saudável) por diferentes subtipos de C. albicans. Além disso, dois ou mais pacientes também podem estar infectados com subtipos idênticos ou não de C. albicans em diferentes sítios anatômicos (i.e.1. idênticos subtipos na secreção vaginal, secreção traqueal e urina; secreção abdominal e escarro; drenagem e cavidade oral; cateter e saliva saudável - i.e.2. diferentes subtipos em lavagem brônquica, secreção orofaríngea, secreção pulmonar, cavidade oral de pacientes imunocomprometidos e sangue). Dados complementares envolvendo amostras de C. albicans isoladas de vários sítios anatômicos de pacientes imunocompetentes ou imunocomprometidos (antes, durante e após terapias específicas) e seus familiares ou trabalhadores hospitalares, deverão ser obtidos a fim de se estabelecer as possíveis fontes de colonização por esses microrganismos. De modo geral, os perfis de proteínas totais obtidos por SDS-PAGE associados com análise numérica computadorizada, permitem a obtenção de critérios adicionais para os estudos epidemiológicos e taxonômicos de C. albicans.

Identificação do vírus do mosaico do tomateiro (ToMV) Tobamovirus, por meio de anticorpos monoclonais

Tomato is a highly important crop for the world economy, and very susceptible to virus diseases, among them the tomato mosaic tobamovirus (ToMV), which causes light and dark green mosaic in the leaves, decreases yield, among other symptoms. With the aim of early identifying ToMV in biological material, harvested from crop fields, monoclonal antibodies (MAbs) were produced against ToMV. The MAb 10.H1 tested through PTA-ELISA (Plate Trapped Antigen--Enzyme-Linked immunosorbent assay), does not cross-react with TMV (tobacco mosaic tobamovirus) or with proteins extracted from plant sap. The MAb was able to identify ToMV from infected plants. The ToMV was isolated, purified and used to re-inoculate tobacco and tomato plants to confirm the symptoms. In immunoblotting assays the MAb recognizes only the band corresponding to the coat protein of the ToMV (17.5 kDa). The MAb 10.H1 opens the possibility to identify ToMV in tomato seedlings avoiding its dissemination in cropped fields.

O tomateiro é uma olerícola de grande importância econômica e uma das mais suscetíveis a viroses, dentre as quais, a causada pelo vírus do mosaico do tomateiro (ToMV), gênero Tobamovirus, que tem como sintomas mosaico verde claro-escuro nas folhas, afilamento dos folíolos e diminuição da produção, entre outros sintomas. Visando a identificação do ToMV, foram produzidos anticorpos monoclonais (MAbs), testados através de PTA- ELISA ("plate trapped antigen- enzyme linked immunoassay"). O MAb (10.H1) foi utilizado para avaliar a capacidade de identificação do ToMV em testes no campo em plantas de tomate infectadas. O MAb não apresentou reação cruzada com TMV (tobamovirus do mosaico do tabaco) nem com extrato de plantas sadias. O ToMV das amostras foi isolado, purificado e re-inoculado em plantas de tomateiro e de tabaco, para confirmação dos sintomas. Em "immunobloting" o MAb 10.H1 reconheceu somente a proteína referente à capa protéica do ToMV (de 17,5 kDa). A especificidade do MAb 10.H1 pode permitir o diagnóstico precoce desta doença na fase de plântulas, ainda em casa de vegetação, evitando assim a disseminação desta virose no campo.

Identificação do vírus do mosaico do tomateiro (ToMV) Tobamovirus, por meio de anticorpos monoclonais

Tomato is a highly important crop for the world economy, and very susceptible to virus diseases, among them the tomato mosaic tobamovirus (ToMV), which causes light and dark green mosaic in the leaves, decreases yield, among other symptoms. With the aim of early identifying ToMV in biological material, harvested from crop fields, monoclonal antibodies (MAbs) were produced against ToMV. The MAb 10.H1 tested through PTA-ELISA (Plate Trapped Antigen--Enzyme-Linked immunosorbent assay), does not cross-react with TMV (tobacco mosaic tobamovirus) or with proteins extracted from plant sap. The MAb was able to identify ToMV from infected plants. The ToMV was isolated, purified and used to re-inoculate tobacco and tomato plants to confirm the symptoms. In immunoblotting assays the MAb recognizes only the band corresponding to the coat protein of the ToMV (17.5 kDa). The MAb 10.H1 opens the possibility to identify ToMV in tomato seedlings avoiding its dissemination in cropped fields.

O tomateiro é uma olerícola de grande importância econômica e uma das mais suscetíveis a viroses, dentre as quais, a causada pelo vírus do mosaico do tomateiro (ToMV), gênero Tobamovirus, que tem como sintomas mosaico verde claro-escuro nas folhas, afilamento dos folíolos e diminuição da produção, entre outros sintomas. Visando a identificação do ToMV, foram produzidos anticorpos monoclonais (MAbs), testados através de PTA- ELISA ("plate trapped antigen- enzyme linked immunoassay"). O MAb (10.H1) foi utilizado para avaliar a capacidade de identificação do ToMV em testes no campo em plantas de tomate infectadas. O MAb não apresentou reação cruzada com TMV (tobamovirus do mosaico do tabaco) nem com extrato de plantas sadias. O ToMV das amostras foi isolado, purificado e re-inoculado em plantas de tomateiro e de tabaco, para confirmação dos sintomas. Em "immunobloting" o MAb 10.H1 reconheceu somente a proteína referente à capa protéica do ToMV (de 17,5 kDa). A especificidade do MAb 10.H1 pode permitir o diagnóstico precoce desta doença na fase de plântulas, ainda em casa de vegetação, evitando assim a disseminação desta virose no campo.

MONOCLONAL ANTIBODIES TO IDENTIFY TOMATO MOSAIC TOBAMOVIRUS (TOMV)

Monoclonal antibodies were obtained against Tomato mosaic tobamovirus (ToMV) isolated in Brazil. One antibody (8G7G2) isotyped as IgG2b (kappa light chain) showed strong specificity and very low cross reaction with the Tobacco mosaic virus (TMV). It can be used in identification of tomato mosaic virus (ToMV).

Foram obtidos anticorpos monoclonais contra o vírus do mosaico do tomateiro (ToMV) isolado no Brasil. O anticorpo 8G7G2 isotipado como IgG2b (cadeia leve kapa apresentou alta especificidade para o ToMV e baixa reação cruzada com o vírus do mosaico do tabaco (TMV) e poderá ser usado na identificação do ToMV.

A simple method for DNA isolation from Xanthomonas spp

A simple DNA isolation method was developed with routine chemicals that yields high quality and integrity preparations when compared to some of the most well known protocols. The method described does not require the use of lysing enzymes, water bath and the DNA was obtained within 40 minutes The amount of nucleic acid extracted (measured in terms of absorbancy at 260 nm) from strains of Xanthomonas spp., Pseudomonas spp. and Erwinia spp. was two to five times higher than that of the most commonly used method.

Foi desenvolvido um método simplificado de isolamento de DNA utilizando substâncias de uso rotineiro facilitando a metodologia e obtendo-se DNA de alta qualidade e integridade quando comparado com os métodos tradicionais. O método descrito não utiliza enzimas líticas, nem banho-maria, e o DNA é obtido em 40 minutos. As quantificações dos DNAs extraídos (medido em D.O. a 260 nm) das dez linhagens de Xanthomonas spp., uma de Pseudomonas spp. e outra de Erwinia spp. mostraram-se de duas a cinco vezes maiores que os métodos conhecidos e suas integridades, testadas em RAPD, apresentaram-se satisfatórias.

A vector carrying the GFP gene (Green fluorescent protein) as a yeast marker for fermentation processes

Contaminant yeasts spoil pure culture fermentations and cause great losses in quality and product yields. They can be detected by a variety of methods although none being so efficient for early detection of contaminant yeast cells that appear at low frequency. Pure cultures bearing genetic markers can ease the direct identification of cells and colonies among contaminants. Fast and easy detection are desired and morphological markers would even help the direct visualization of marked pure cultures among contaminants. The GFP gene for green fluorescent protein of Aquorea victoria, proved to be a very efficient marker to visualize transformed cells in mixed populations and tissues. To test this marker in the study of contaminated yeast fermentations, the GFP gene was used to construct a vector under the control of the ADH2 promoter (pYGFP3). Since ADH2 is repressed by glucose the expression of the protein would not interfere in the course of fermentation. The transformed yeasts with the vector pYGFP3 showed high stability and high bioluminescence to permit identification of marked cells among a mixed population of cells. The vector opens the possibility to conduct further studies aiming to develop an efficient method for early detection of spoilage yeasts in industrial fermentative processes.

Leveduras contaminantes podem causar grandes perdas em processos fermentativos quando infectam culturas puras e degradam a qualidade do produto final. Estas leveduras podem ser detectadas por diversos métodos mas nenhum deles oferece resultados com a exatidão e precisão necessárias, quando os contaminantes estão em baixa freqüência. Culturas puras contendo um gene marcador podem ser utilizadas para a direta identificação de células e colônias contaminantes. Detecção rápida e fácil é desejada e marcadores morfológicos podem auxiliar na visualização da cultura marcada. O gene da GFP (green fluorescent protein) extraído da Aequorea victoria mostrou-se eficiente para marcação de células, oferecendo ainda uma fácil visualização das populações e tecidos marcados. Para testar este marcador no estudo de leveduras contaminantes, o gene GFP foi usado para construir um vetor, sob o controle do promotor de ADH2, que é reprimido por glicose, não interferindo assim em nenhuma etapa do processo. A inserção do vetor com a GFP (pYGFP3) em leveduras foi um sucesso, demonstrando alta estabilidade e oferecendo com certeza, um novo método com alta eficiência para o controle de contaminantes em processos fermentativos além de servir como marcador destinado a proteção industrial do material genético.

A vector carrying the GFP gene (Green fluorescent protein) as a yeast marker for fermentation processes

Contaminant yeasts spoil pure culture fermentations and cause great losses in quality and product yields. They can be detected by a variety of methods although none being so efficient for early detection of contaminant yeast cells that appear at low frequency. Pure cultures bearing genetic markers can ease the direct identification of cells and colonies among contaminants. Fast and easy detection are desired and morphological markers would even help the direct visualization of marked pure cultures among contaminants. The GFP gene for green fluorescent protein of Aquorea victoria, proved to be a very efficient marker to visualize transformed cells in mixed populations and tissues. To test this marker in the study of contaminated yeast fermentations, the GFP gene was used to construct a vector under the control of the ADH2 promoter (pYGFP3). Since ADH2 is repressed by glucose the expression of the protein would not interfere in the course of fermentation. The transformed yeasts with the vector pYGFP3 showed high stability and high bioluminescence to permit identification of marked cells among a mixed population of cells. The vector opens the possibility to conduct further studies aiming to develop an efficient method for early detection of spoilage yeasts in industrial fermentative processes.

Leveduras contaminantes podem causar grandes perdas em processos fermentativos quando infectam culturas puras e degradam a qualidade do produto final. Estas leveduras podem ser detectadas por diversos métodos mas nenhum deles oferece resultados com a exatidão e precisão necessárias, quando os contaminantes estão em baixa freqüência. Culturas puras contendo um gene marcador podem ser utilizadas para a direta identificação de células e colônias contaminantes. Detecção rápida e fácil é desejada e marcadores morfológicos podem auxiliar na visualização da cultura marcada. O gene da GFP (green fluorescent protein) extraído da Aequorea victoria mostrou-se eficiente para marcação de células, oferecendo ainda uma fácil visualização das populações e tecidos marcados. Para testar este marcador no estudo de leveduras contaminantes, o gene GFP foi usado para construir um vetor, sob o controle do promotor de ADH2, que é reprimido por glicose, não interferindo assim em nenhuma etapa do processo. A inserção do vetor com a GFP (pYGFP3) em leveduras foi um sucesso, demonstrando alta estabilidade e oferecendo com certeza, um novo método com alta eficiência para o controle de contaminantes em processos fermentativos além de servir como marcador destinado a proteção industrial do material genético.

A simple method for DNA isolation from Xanthomonas spp.

A simple DNA isolation method was developed with routine chemicals that yields high quality and integrity preparations when compared to some of the most well known protocols. The method described does not require the use of lysing enzymes, water bath and the DNA was obtained within 40 minutes The amount of nucleic acid extracted (measured in terms of absorbancy at 260 nm) from strains of Xanthomonas spp., Pseudomonas spp. and Erwinia spp. was two to five times higher than that of the most commonly used method.

Foi desenvolvido um método simplificado de isolamento de DNA utilizando substâncias de uso rotineiro facilitando a metodologia e obtendo-se DNA de alta qualidade e integridade quando comparado com os métodos tradicionais. O método descrito não utiliza enzimas líticas, nem banho-maria, e o DNA é obtido em 40 minutos. As quantificações dos DNAs extraídos (medido em D.O. a 260 nm) das dez linhagens de Xanthomonas spp., uma de Pseudomonas spp. e outra de Erwinia spp. mostraram-se de duas a cinco vezes maiores que os métodos conhecidos e suas integridades, testadas em RAPD, apresentaram-se satisfatórias.

Imobilização da inulinase de Kluyveromyces marxianus para a hidrólise de extratos de Helianthus tuberosus L

This experiment studied the immobilization of inulinase from Kluyveromyces marxianus in different supports to bioconvert the inulin from Helianthus tuberosus. Inulin was extracted from H. tuberosus tubers, desproteinized and concentrated to 25% total reducing sugars. Inulinase from K. marxianus was concentrated in a rotative evaporator and immobilized onto chitin (with and without glutaraldehyde), sodium alginate (2 and 4%), pectin, a dialysis membrane or controlled-porosity silicate. On chitin, with or without glutaraldehyde, the imobilization rate was 73 and 48 U g-1 respectively. However the hydrolysys of 1g L-1 inulin was very low in both treatments (2.4 % per hour). In sodium alginate gel of 2% and 4% concentration, the conversion was 12% and 26% per hour, respectively. Immobilization onto pectin was not possible due to a high activity pectinase in the enzyme extract. Binding of the enzyme onto dialysis membrane provided recovery of 50% total reducing sugars (42g) in 6h of operation. The controlled-porosity silicate showed an imobilization rate of 43 U g-1 silicate, hydrolyzing 43% of substrate per hour. This activity was, however, exhausted quickly during the process.

Este trabalho estudou a imobilização da inulinase de Kluyveromyces marxianus em diferentes suportes, com a finalidade de promover a bioconversão da inulina de Helianthus tuberosus. A inulina de H. tuberosus foi extraída dos tubérculos, desproteinizada e concentrada a 25% de açúcares redutores totais (ART). A inulinase de K. marxianus foi concentrada em evaporador rotativo e imobilizada em quitina (com e sem glutaraldeído), alginato sódico (concentrações de 2 e 4%), pectina, membrana de diálise e sílica de porosidade controlada (SPC). Em quitina obteve-se taxas de imobilização de 73Unidades/g com glutaraldeído e 48 U/g sem glutaraldeído, mas a hidrólise foi baixa em ambos os tratamentos, o equivalente a 2,4% por hora. Em gel de alginato sódico, nas concentrações de 2 e 4%, converteram-se, respectivamente, 12% e 26%, em 1h. A imobilização em pectina foi impossibilitada devido à presença de pectinase no extrato enzimático. A contenção da enzima com o substrato em membrana de diálise proporcionou uma recuperação de 50% do ART em 6h. A SPC apresentou taxa de imobilização de 43 U/g sílica, proporcionando a hidrólise de 43% em 1h, entretanto sua atividade foi se exaurindo rapidamente durante o processo devido à inativação natural da enzima e a conformação dos poros da SPC.

Imobilização da inulinase de Kluyveromyces marxianus para a hidrólise de extratos de Helianthus tuberosus L.

This experiment studied the immobilization of inulinase from Kluyveromyces marxianus in different supports to bioconvert the inulin from Helianthus tuberosus. Inulin was extracted from H. tuberosus tubers, desproteinized and concentrated to 25% total reducing sugars. Inulinase from K. marxianus was concentrated in a rotative evaporator and immobilized onto chitin (with and without glutaraldehyde), sodium alginate (2 and 4%), pectin, a dialysis membrane or controlled-porosity silicate. On chitin, with or without glutaraldehyde, the imobilization rate was 73 and 48 U g-1 respectively. However the hydrolysys of 1g L-1 inulin was very low in both treatments (2.4 % per hour). In sodium alginate gel of 2% and 4% concentration, the conversion was 12% and 26% per hour, respectively. Immobilization onto pectin was not possible due to a high activity pectinase in the enzyme extract. Binding of the enzyme onto dialysis membrane provided recovery of 50% total reducing sugars (42g) in 6h of operation. The controlled-porosity silicate showed an imobilization rate of 43 U g-1 silicate, hydrolyzing 43% of substrate per hour. This activity was, however, exhausted quickly during the process.

Este trabalho estudou a imobilização da inulinase de Kluyveromyces marxianus em diferentes suportes, com a finalidade de promover a bioconversão da inulina de Helianthus tuberosus. A inulina de H. tuberosus foi extraída dos tubérculos, desproteinizada e concentrada a 25% de açúcares redutores totais (ART). A inulinase de K. marxianus foi concentrada em evaporador rotativo e imobilizada em quitina (com e sem glutaraldeído), alginato sódico (concentrações de 2 e 4%), pectina, membrana de diálise e sílica de porosidade controlada (SPC). Em quitina obteve-se taxas de imobilização de 73Unidades/g com glutaraldeído e 48 U/g sem glutaraldeído, mas a hidrólise foi baixa em ambos os tratamentos, o equivalente a 2,4% por hora. Em gel de alginato sódico, nas concentrações de 2 e 4%, converteram-se, respectivamente, 12% e 26%, em 1h. A imobilização em pectina foi impossibilitada devido à presença de pectinase no extrato enzimático. A contenção da enzima com o substrato em membrana de diálise proporcionou uma recuperação de 50% do ART em 6h. A SPC apresentou taxa de imobilização de 43 U/g sílica, proporcionando a hidrólise de 43% em 1h, entretanto sua atividade foi se exaurindo rapidamente durante o processo devido à inativação natural da enzima e a conformação dos poros da SPC.