Selección y optimización de los métodos basados en PCR para la detección de Histoplasma capsulatum var. capsulatum / Selection and optimization of PCR-based methods for the detection of Histoplasma capsulatum var. capsulatum

Antecedentes. Los métodos actuales para el diagnóstico de laboratorio de la histoplasmosis son problemáticos si consideramos los valores de sensibilidad, especificidad y tiempo de ejecución. Objetivos. En este estudio hemos tratado de seleccionar y optimizar los métodos para la detección de Histoplasma capsulatum var. capsulatum mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Métodos. Se evaluaron tres métodos de extracción de ADN y tres métodos de PCR. Se optimizó la concentración de los componentes de esta reacción de PCR y se determinó su co-positividad (sensibilidad) y co-negatividad (especificidad), utilizando muestras de sangre a las que se había añadido H. capsulatum. Resultados. El método de extracción que dio el ADN de más alta calidad utiliza membranas de sílice (DNeasy Blood & Tissue Kit, Qiagen, Hilden, Germany), y el método de PCR con mayor capacidad de detección es el que incluye un gen diana que codifica una proteína de 100 kDa. Nuestra optimización de las condiciones de PCR indicaron que la reacción trabaja en un rango significativo de las concentraciones de componentes y, además, fue capaz de detectar H. capsulatum mejor que las técnicas de cultivo tradicional, con un límite de detección de solo 10 pg de ADN. Conclusiones. En nuestras condiciones experimentales, el método PCR seleccionado en este trabajo (en lugar de PCR anidada) es una herramienta lo suficientemente sensible para el diagnóstico de la histoplasmosis

Background. Current methods for the laboratory diagnosis of histoplasmosis are problematic in terms of their sensitivity, specificity and runtime. Objectives. Thus, in this study, we sought to select and optimize methods for the detection of Histoplasma capsulatum var. capsulatum by polymerase chain reaction (PCR). Methods. Three DNA extraction methods and three PCR methods were evaluated. We optimised the concentration of the components of this PCR reaction and determined its sensitivity and specificity using blood samples to which H. capsulatum had been added. Results. The DNA extraction method that yielded the highest-quality DNA used silica membranes (DNeasy Blood & Tissue Kit, Qiagen, Hilden, Germany), and the amplification method with the best detection capacity used a target gene encoding a 100-kDa protein. Our optimisation of the PCR conditions indicated that the reaction works over a significant range of component concentrations; in addition, it was able to detect H. capsulatum better than traditional culture techniques, with a detection limit of only 10 pg of DNA. Conclusions. In our experimental conditions, the PCR method selected in this work (instead of nested-PCR) is a tool sensitive enough for the diagnosis of histoplasmosis(AU)

Pesquisa de Micobactérias Ambientais em água de torneira, luvas e soluções utilizadas em procedimentos cirúrgicos no Hospital Universitário Getúlio Vargas - Manaus/AM

Using bacteriological (culture) and molecular (PCR - Restriction Enzyme Analysis, PRA) methods, we investigated the presence of environmental mycobacteria in tap water, antiseptic solutions and surgical gloves, used in carrying out surgical procedures at the Getúlio Vargas University Hospital Surgical Center, in Manaus -Amazonas/Brazil. Samples (105) were collected and analyzed from: tap water (24 - collected from 3 taps in the surgical center); povidone-iodine solution, PVP-I, (8); Chlorhexidine solution (7), that were used to hygienize surgeons' hands; surgical gloves (39); and solutions that were effectively used during the surgical procedure (27). Using bacteriological method 41 mycobacteria were isolated, all from samples of tap water. Using PRA, mycobacterial DNA was detected only in the sample from water that provided over 100 colonies per inoculated culture tubes. The isolated were identified as Mycobacterium celatum pattern II, M. gordonae pattern III, M. gordonae pattern VI, M. intracellulare pattern I, M. lentiflavum pattern III and M. mucogenicum pattern I. The isolating of M. mucogenicum, a species that had already been incriminated for causing post-surgical outbreaks in tap water from the surgical center, indicates that cleaning and monitoring procedures must be carried out in every place of water distribution. This may be necessary to prevent nosological mycobacteriosis outbreaks induced by the use of water in different activities such as handling and hygienizing patients submitted to invasive procedures.

Investigou-se por métodos bacteriológicos (cultivo) e moleculares (PCR - Restriction Enzyme Analysis, PRA), a presença de micobactérias ambientais em águas de torneira, soluções e luvas cirúrgicas, utilizadas nas etapas dos procedimentos cirúrgicos executados no centro cirúrgico do Hospital Universitário Getulio Vargas (HUGV), na cidade de Manaus-Amazonas/Brasil. Foram colhidas e analisadas 105 amostras sendo: 24 de águas (colhidas das 2 torneiras existentes no centro cirúrgico), 8 de solução de Povidine e 7 de solução de Clorhexidina, que servem para a higienização das mãos dos cirurgiões; 39 de luvas cirúrgicas (superfícies internas e externas); e 27 de soluções que foram efetivamente utilizadas durante o ato cirúrgico. Por método bacteriológico obteve-se 41 isolados micobacterianos apenas de águas das torneiras. Pelo PRA obteve-se a detecção de DNA micobacteriano somente na amostra de água que forneceu acima de 100 colônias de micobactérias por tubo semeado. Os isolados foram identificados como sendo Mycobacterium celatum perfil 2, M. gordonae perfil 3, M. gordonae perfil 6, M. intracellulare perfil 1, M. lentiflavum perfil 3 e M. mucogenicum perfil 1. O encontro de M. mucogenicum, espécie já incriminada em surtos pós-cirúrgicos, indica que devem ser efetuados procedimentos de limpeza e monitoramento em todos os pontos de distribuição de águas, visando à prevenção de surtos de micobacterioses nosocomiais induzidos pelo uso das águas nas diferentes atividades de manuseio ou higienização dos pacientes submetidos a procedimentos invasivos.

Lay use of amazonian plants for the treatment of tuberculosis

The Brazilian State of Amazonas has a high incidence of Tuberculosis, 91.4 in 10,000 habitants (SESAU, 1994) and resistant strains of Mycobacterium tuberculosis are frequently being found in the region (SALEM et.al, 1990). These problems have been associated with side effects caused by the antibiotics used to treat Tuberculosis, which have in rum been associated with treatment non-compliance (PATTISAPU, 1984). To resolve this problem a cost effective alternative treatment for Tuberculosis with few or no side effects, needs to be found. Amazonas has an abundance of plants, many of which are used by the lay population for medicinal purposes. A survey was carried out in five towns of the region, interviewing patients receiving treatment for Tuberculosis, to find out whether and which plants have been used to treat Tuberculosis. Results showed that the majority of patients in the sample had used medicinal plants before or after diagnosis of Tuberculoses. Thirteen different plants were recorded for this purpose. Chenopodium ambrosioides L, popularly known as Mastruz, was the most commonly used, followed by Caesalpinia ferrea Mart. Jucá and Spilanthes acmella DC. Jambu. This study concentrates on Mastruz as it was used more frequently than the other medicinal plants. No significant effects on baciloscopy test results were found when Mastruz was used before diagnosis. ln-vitro laboratory tests have also not shown any tuberculocidal effects for Mastruz. Further tests are being carried out on the other medicinal plants.

O Estado do Amazonas tem uma alta incidência de tuberculose, 91.4 por 10,000 habitantes (SESAU, 1994), e freqüentemente novas cepas de Mycobacterium tuberculosis resistentes a diversos antibióticos são encontrados (SALEM et.al, 1990). O abandono terapêutico está sendo relacionada aos efeitos colaterais desses antibióticos, contribui para este quadro (PATTISAPU, 1984). Assim faz-se necessário a descoberta de substâncias alternativas com baixo nível de efeitos colaterais negativos para o tratamento de tuberculose. Neste estado existe abundância de plantas utilizadas pela população no combate a várias doenças. Um levantamento foi feito com portadores de tuberculose emtratamento alopático em cinco municípios do estado do Amazonas, para descobrir quais são as plantas utilizadas por eles. Os resultados mostraram que a maioria dos pacientes entrevistados utilizavam plantas medicinas antes e/ou após tratamento alopático. Treze plantas foram citadas como plantas medicinais e utilizadas no tratamento de tuberculose. Chenopodium ambrosioides L., popularmente conhecida por mastruz, foi relatada como a planta mais utilizada, seguida pela Caesalpinia ferrea Mart., jucá e Spilanthes acmella D.C., jambu. Este estudo se concentra no mastruz por causa da baixa utilização das outras. Não encontramos um efeito significativo no comportamento baciloscópio quando o mastruz foi utilizada antes da diagnóstico. Testes de laboratórios "in-vitro" também não mostraram um resultado tubeculocida para mastruz. Outros testes estão sendo feito com as outras plantas citadas.

Mycobacteria other than tubercle bacilli in sputum specimens from patients in Manaus (Amazonia, Brasil)

SUMMARYMycobacteria which are most commonly isolated in pulmonary secretions of patients with respiratory symptoms living in the State of Amazonas are given. The high percentage of isolates (25,4) and the species obtained indicate a strong relationship of contamination of man by the environment. Among the species isolated, seven of them are considered potentially pathogenic mycobacteria. Since some of these species may interfere with present and further vaccination programs against Tuberculosis and Leprosy, these investigations indicate a necessity of carrying out studies of population awareness against specific PPD's prepared from the same species.

RESUMOSão apresentadas as espécies micobaterianas mais comumente isoladas de secreções pulmonares de pacientes com sintomatologia respiratória, residentes no Estado do Amazonas. O alto percentual de isolamentos (25,4%) e as espécies obtidas indicam uma forte relação de contaminação do homem pelo meio-ambiente. Entre as espécies isoladas, 7 são consideradas micobactérias potencialmente patogênicas. Isto indica a necessidade de realizar-se estudos de sensibilização na população, através de PPDs específicos para as espécies relatadas já que , algumas destas espécies podem interferir com os programas atuais e futuros de vacinação contra a Tuberculose e Hanseníase.

Poluição e autopurificação do rio Negro nas cercanias de Manaus

Summary This paper presents a survey of some aspects of Rio Negro water quality in the vicinity of Manaus, Amazonas, Brazil. Measurements of temperature. pH, electrical conductivity, light penetration (Secchi), saprophyte and total coliform bacteria, were carried out from January through December of 1977. The samples were collected at two depths at eleven places along the river and from two streams at the outskirts of the town. The results are discussed from a sanitary point of view and the autopurification capacity of the river is emphasized.

Resumo São apresentados os dados coletados em um levantamento sobre a qualidade de água do rio Negro, nas proximidades da cidade de Manaus, Amazonas. Foram medidos alguns parâmetros físico químicos, tais como temperatura, pH, condutividade elétrica, transparência de Secchi e avaliadas as condições microbiológicas da quantidade de bactérias saprobiontes totais e coliformes totais, durante o ano de 1977. O trabalho foi realizado com coletas mensais, em nove locais ao longo do rio e em dois igarapés que margeiam a cidade, com amostragens em duas profundidades. Discute-se a importância dos resultados sob o ponto de vista sanitário e ressalta-se a capacidade de autopurificação do rio.