Molecular identification of Leishmania spp. clinical isolates from Colombia based on hsp70 gene.

INTRODUCTION: Leishmaniasis is highly prevalent in Colombia, where at least six different species can cause disease of varying clinical presentations in humans. The identification of the infecting species is quite important for prognosis, therapeutics and epidemiology. Different techniques with variable discriminatory power have been used for the identification.  OBJECTIVE: To carry out the molecular identification of Leishmania species through the amplification of a fragment of the hsp70 gene.  MATERIALS AND METHODS: Molecular amplification of the hsp70 gene fragment (PCR-hsp70) followed by restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP) was done for identification purposes using DNA from 81 clinical isolates of Leishmania.  RESULTS: A single amplicon was obtained for all samples analyzed. The enzymatic restrictions of the 81 PCR products identified 70 with a banding pattern corresponding to L. braziliensis with two different patterns (62 and eight isolates, respectively), nine isolates compatible with L. panamensis and two with L. guyanensis. The geographical origin of the isolates is consistent with previous reports about the distribution of the corresponding species in Colombia.  CONCLUSIONS: The PCR-hsp70/RFLP technique used is a valid tool for the identification of Leishmania species isolated from clinical samples of patients in Colombia, which may also be applicable to the study of strains obtained from vectors and reservoirs with epidemiological significance.

Identificación molecular con base en el gen hsp 70 de aislamientos clínicos de Leishmania spp. en Colombia / Molecular identification of Leishmania spp. in clinical isolates from Colombia based on hsp 70 gene

Introducción. La leishmaniasis es una enfermedad de gran prevalencia en Colombia, donde al menos seis especies diferentes la originan en el ser humano, con un amplio rango de características clínicas. La tipificación de la especie es importante, no solo desde el punto de vista epidemiológico, sino para el diagnóstico, dado que el tratamiento puede variar dependiendo de la especie identificada. En la identificación se han utilizado varias alternativas metodológicas con diferentes niveles de poder discriminatorio. Objetivo. Identificar especies de Leishmania mediante la amplificación molecular de un fragmento del gen hsp 70. Materiales y métodos. Se amplificó un fragmento del gen hsp 70 mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR- hsp 70) y se hizo el análisis de los polimorfismos de la longitud ( Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) de los fragmentos de restricción de 81 aislamientos clínicos de Leishmania spp. de pacientes con leishmaniasis cutánea y mucocutánea para la identificación de las especies presentes. Resultados. Se obtuvo un solo amplicón para todas las muestras analizadas. La restricción enzimática de los 81 productos permitió la identificación de 70 con dos patrones de bandas que correspondían a dos alelos de Leishmania braziliensis (62 y ocho aislamientos, respectivamente), nueve aislamientos compatibles con L. panamensis y dos con L. guyanensis . El origen geográfico de los aislamientos coincidió con el de reportes previos sobre la distribución de dichas especies en Colombia. Conclusiones. La técnica de la PCR- hsp 70 y el análisis de RFLP fueron útiles para identificar las especies de Leishmania aisladas de muestras clínicas de Colombia y pueden aplicarse también en el estudio de cepas de vectores y reservorios de importancia epidemiológica.

Introduction: Leishmaniasis is highly prevalent in Colombia, where at least six different species can cause disease of varying clinical presentations in humans. The identification of the infecting species is quite important for prognosis, therapeutics and epidemiology. Different techniques with variable discriminatory power have been used for the identification. Objective: To carry out the molecular identification of Leishmania species through the amplification of a fragment of the hsp 70 gene. Materials and methods: Molecular amplification of the hsp 70 gene fragment (PCR- hsp 70) followed by restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP) was done for identification purposes using DNA from 81 clinical isolates of Leishmania . Results: A single amplicon was obtained for all samples analyzed. The enzymatic restrictions of the 81 PCR products identified 70 with a banding pattern corresponding to L. braziliensis with two different patterns (62 and eight isolates, respectively), nine isolates compatible with L. panamensis and two with L. guyanensis . The geographical origin of the isolates is consistent with previous reports about the distribution of the corresponding species in Colombia. Conclusions: The PCR- hsp 70/RFLP technique used is a valid tool for the identification of Leishmania species isolated from clinical samples of patients in Colombia, which may also be applicable to the study of strains obtained from vectors and reservoirs with epidemiological significance.

PCR-RFLP y RAPD para la tipificación de Leishmania neotropical / PCR-RFLP and RAPD for typing neotropical Leishmania

Introducción. El análisis de la longitud de los fragmentos de restricción del producto amplificado y el estudio del ADN polimórfico amplificado al azar han demostrado ser herramientas útiles para la tipificación de Leishmania. Objetivos. Estudiar la utilidad de las técnicas moleculares para la identificación y tipificación de cepas de referencia de Leishmania spp. del Nuevo Mundo y valorar su aplicabilidad a muestras clínicas. Materiales y métodos. Se aplicó PCR para amplificar el gen que codifica la cisteíno-proteinasa B, y el análisis de la longitud de los fragmentos de restricción del producto amplificado utilizando ácido desoxirribonucleico de 16 cepas de referencia de Latinoamérica y de muestras clínicas de pacientes colombianos con leishmaniasis, y la técnica del ácido desoxirribonucleico polimórfico amplificado al azar utilizando ocho cepas de referencia. Se establecieron los patrones de bandas en cada caso. Resultados. Se obtuvo producto de amplificación en la PCR para Leishmania braziliensis, L. peruviana, L. panamensis y L. guyanensis. Para el resto, no fue posible amplificar el gen con los cebadores utilizados. La restricción mostró un patrón de bandas común para L. peruviana, L. guyanensis y L. panamensis, mientras L. braziliensis, presentaba un perfil individual único. El análisis de restricción del producto amplificado generó un patrón de bandas similar en los cinco pacientes estudiados, que se correspondía con el patrón generado por L. peruviana, L. guyanensis o L. panamensis. Mediante la amplificación al azar se obtuvieron patrones de bandas reproducibles con todas las cepas estudiadas, que posibilitaron la diferenciación. Se discuten las ventajas y limitaciones de ambos procederes. Conclusiones. El combinar ambas metodologías resultaría útil para identificar especies de importancia médica, tomando en cuenta sus ventajas y desventajas.

[PCR-RFLP and RAPD for typing neotropical Leishmania]. / PCR-RFLP y RAPD para la tipificación de Leishmania neotropical.

INTRODUCTION: The analysis of the PCR-restriction fragment length polymorphism and random amplified polymorphic DNA have been useful tools for Leishmania identification. OBJECTIVES: Molecular procedures were demonstrated for identification and typing of reference strains of New World Leishmania and their applicability was validated for clinical samples. MATERIALS AND METHODS: DNA was extracted from 16 reference strains of Latin American Leishmania as well as from clinical samples of leishmaniasis patients. A sequence coding for cysteine proteinase B was amplified by PCR and subjected to restriction fragment length polymorphism analysis. The enzyme used was Taq1. For eight of the reference strains, the random amplified polymorphic desoxyribonucleic acid technique (RAPD) was applied. Band patterns for Leishmania species differentiation were established each each method. The sample size of the clinical sample was of 5. RESULTS: PCR products of the cysteine proteinase B gene were obtained for L. braziliensis, L. peruviana, L. panamensis and L. guyanensis. For the other species, L. mexicana, L. amazonensis, L. garnhami, L. lainsoni, L. chagasi, L. naiffi, no amplification occurred. The patterns of restriction fragments revealed band patterns in common for L. peruviana, L. guyanensis and L. panamensis, whereas L. braziliensis had a distinctive pattern. When human samples were examined, amplification occurred for all cases, and the profiles corresponded to the common profile of L. peruviana, L. guyanensis and L. panamensis. The RAPD technique demonstrated reproducible and distinctive patterns for each of the 8 reference strains, L. mexicana, L. amazonensis, L. garnhami, L. lainsoni, L. chagasi, L. naiffi, making possible to differentiate all them. The advantages and limitations of each procedure are discussed. CONCLUSIONS: The combination of RFP and RAPD methodologies provide useful tools to identify medical important species of Leishmania by recognizing DNA sequences characteristic of each species.

PCR-RFLP y RAPD para la tipificación de Leishmania neotropical / PCR-RFLP and RAPD for typing neotropical Leishmania

El análisis de la longitud de los fragmentos de restricción del producto amplificado y el estudio del ADN polimórfico amplificado al azar han demostrado ser herramientas útiles para la tipificación de Leishmania.Objetivos. Estudiar la utilidad de las técnicas moleculares para la identificación y tipificación de cepas de referencia de Leishmania spp. del Nuevo Mundo y valorar su aplicabilidad a muestras clínicas.Materiales y métodos. Se aplicó PCR para amplificar el gen que codifica la cisteíno-proteinasa B, y el análisis de la longitud de los fragmentos de restricción del producto amplificado utilizando ácido desoxirribonucleico de 16 cepas de referencia de Latinoamérica y de muestras clínicas de pacientes colombianos con leishmaniasis, y la técnica del ácido desoxirribonucleico polimórfico amplificado al azar utilizando ocho cepas de referencia. Se establecieron los patrones de bandas en cada caso(AU)

PCR-RFLP/Hsp70 para identificar y tipificar Leishmania de la región neotropical / PCR-RFLP/Hsp70 for identification and tipification of Leishmania from the tropical region

Se realizó la estandarización de las condiciones de amplificación del gen que codifica para la proteína de choque térmico de 70 kDa (Hsp70) de Leishmania mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR-Hsp70), así como el análisis posterior de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) del producto amplificado, utilizando como molde ADN puro de una cepa de referencia de Leishmania mexicana. Se estudió la sensibilidad y especificidad analíticas de la PCR, así como la reproducibilidad, utilizando ADN de L. mexicana, L. amazonensis, L. guyanensis y L. lainsoni. Se obtuvo una banda de 1,3 Kpb, demostrándose la amplificación del gen que codifica para la Hsp70. Los patrones de bandas obtenidos tras la digestión enzimática, utilizando la enzima Hae III, permitieron establecer diferencias entre las especies estudiadas: L. guyanensis y L. lainsoni se diferencian entre sí y estas a su vez de L. mexicana y L. amazonensis, que mostraron un patrón de bandas común. La sensibilidad y especificidad analíticas de la técnica fueron adecuadas. Se demostró la factibilidad de identificar y tipificar especies del continente americano mediante la PCR-RFLP/Hsp70, y de utilizar la restricción enzimática del producto amplificado para distinguir entre Leishmania spp. y Trypanosoma cruzi, dándose un primer paso en el establecimiento de estos métodos moleculares en el laboratorio de referencia del instituto(AU)

PCR-RFLP/Hsp70 para identificar y tipificar Leishmania de la región neotropical / PCR-RFLP/Hsp70 for identification and tipification of Leishmania from the tropical region

Se realizó la estandarización de las condiciones de amplificación del gen que codifica para la proteína de choque térmico de 70 kDa (Hsp70) de Leishmania mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR-Hsp70), así como el análisis posterior de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) del producto amplificado, utilizando como molde ADN puro de una cepa de referencia de Leishmania mexicana. Se estudió la sensibilidad y especificidad analíticas de la PCR, así como la reproducibilidad, utilizando ADN de L. mexicana, L. amazonensis, L. guyanensis y L. lainsoni. Se obtuvo una banda de 1,3 Kpb, demostrándose la amplificación del gen que codifica para la Hsp70. Los patrones de bandas obtenidos tras la digestión enzimática, utilizando la enzima Hae III, permitieron establecer diferencias entre las especies estudiadas: L. guyanensis y L. lainsoni se diferencian entre sí y estas a su vez de L. mexicana y L. amazonensis, que mostraron un patrón de bandas común. La sensibilidad y especificidad analíticas de la técnica fueron adecuadas. Se demostró la factibilidad de identificar y tipificar especies del continente americano mediante la PCR-RFLP/Hsp70, y de utilizar la restricción enzimática del producto amplificado para distinguir entre Leishmania spp. y Trypanosoma cruzi, dándose un primer paso en el establecimiento de estos métodos moleculares en el laboratorio de referencia del instituto.

Necesidad del uso de cromógenos para cuantificar promastigotes de Leishmania en placas de 96 pozos / Necessity of the cromógenos use to quantify promastigotes of Leishmania in badges of 96 wells

Las dificultades que aún persisten en el tratamiento de las leishmaniosis justifican el ensayo de la acción de nuevos productos sobre formas del parásito, en la búsqueda de una alternativa terapéutica a esta parasitosis. Dada la necesidad de establecer un procedimiento para evaluar la actividad in vitro de productos naturales y sintéticos en las condiciones cubanas, el propósito de este trabajo fue definir la utilidad del uso del p-nitrofenilfosfato como sustancia cromógena para la cuantificación de parásitos en placas de 96 pozos. Para normalizar este método colorimétrico se establecieron las etapas de la curva de crecimiento del parásito. El estudio de linealidad y selección del volumen de muestra que resultaba óptimo para la realización de los ensayos mostró que con 200 mm se obtuvo el máximo coeficiente de determinación lineal. Asimismo, se comparó el coeficiente de variación en presencia y ausencia del cromógeno y se estudió la influencia de los cambios del medio de cultivo en la lectura de las absorbancias. El límite de cuantificación establecido demostró la necesidad del uso del cromógeno para los propósitos de este trabajo y los resultados en general permiten recomendar esta metodología, menos subjetiva, simple de ejecutar y rápida, para ensayar los productos que resulten de interés en este campo(AU)

Necesidad del uso de cromógenos para cuantificar promastigotes de Leishmania en placas de 96 pozos / The need for the use of chromogens for quantifying Leishmania promastigotes on plates from 96 wells

The existing difficulties in the treatment of leishmaniasis justify the testing of the effect of new products on parasite forms in the search of a therapeutic alternative for the parasitosis. Given the need of establishing a method to evaluate the activity of natural synthetic products in vitro under the Cuban conditions, this paper was aimed at defining the usefulness of p-nitrophenilphosphate as a chromogenic substance for quantification of parasites in plaques from 96 wells. To standardize this colorimetric method the stages of the parasite growth curve were set. The study of linearity and selection of the sample size, which was optional for these assays, showed that it was possible to obtain maximum linear determination coefficient with 20 mm. Likewise, the variation coefficient was compared with and without the chromogen and the effect of changes in culture medium on the reading of absorbances was analyzed. The set limit of quantification proved the need of using chromogen for the purposes of this paper and the general results allow to recommend this less subjective, simpler and quicker methodology to test products of interest in this field.

Demostración, mediante enzymeba, del sobrediagnóstico de amebiasis intestinal asociado al examen microscópico de heces.Reporte de un estudio en Cienfuegos,Cuba / Demonstration, using Enzymeba test, of the overdiafnosis of instestinal amebiasis associated to the microscopical examination of faeces.Report of a study in Cienfuegos,Cuba

El sobrediagnóstico microscópico de amebiasis intestinal ha sido ampliamente reportado pero pocas veces objetivamente demostrado. En el presente trabajo, empleando Enzymeba, un procedimiento diagnóstico de amebiasis intestinal desarrollado en el Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí", Ciudad de La Habana, abordamos este problema. Duranteseis meses se colectaron en los servicios de parasitologia de la casi totalidad de los policlínicos(13 de 14), y de los dos mayores hospitales(2 de 3) de la provincia de Cienfuegos, todas las muestras de heces en las que el personal técnico correspondiente había ing/formado la detección por observación microscópica de uno o más estadíos de Entamoeba histolytica. En sólo 61(14,4 por cento) de 424 muestras colectadas Enzymeba confirmó el hallazgo microscópico previo. No encontramos diferencia estadísticamente significativa(p>0.05) entre la eficiencia del diagnóstico microscópico en los policlínicos de aquella provincia.

Demostración mediante enzymeba del sobrediagnóstico de amebiasis intestinal asociado al examen microscópico de heces: reporte de un estudio en Cienfuegos, Cuba / Demostration using Enzymeba test of the overdiafnosis of instestinal amebiasis associated to the microscopical examination of faeces: report of a study in Cienfuegos, Cuba

El sobrediagnóstico microscópico de amebiasis intestinal ha sido ampliamente reportado pero pocas veces objetivamente demostrado. En el presente trabajo, empleando Enzymeba, un procedimiento diagnóstico de amebiasis intestinal desarrollado en el Instituto de Medicina Tropical Pedro Kourí, Ciudad de La Habana, abordamos este problema. Duranteseis meses se colectaron en los servicios de parasitologia de la casi totalidad de los policlínicos(13 de 14), y de los dos mayores hospitales(2 de 3) de la provincia de Cienfuegos, todas las muestras de heces en las que el personal técnico correspondiente había informado la detección por observación microscópica de uno o más estadíos de Entamoeba histolytica. En sólo 61(14,4 por ciento) de 424 muestras colectadas Enzymeba confirmó el hallazgo microscópico previo. No encontramos diferencia estadísticamente significativa(p>0.05) entre la eficiencia del diagnóstico microscópico en los policlínicos de aquella provincia(AU)