ABSTRACT
BACKGROUND: Nephron progenitor cells derived from the metanephric mesenchyme undergo a complex balance of self-renewal and differentiation throughout kidney development to give rise to the mature nephron. Cell proliferation is an important index of progenitor population dynamics. However, accurate and reproducible in situ quantification of cell proliferation within progenitor populations can be technically difficult to achieve due to the complexity and harsh tissue treatment required of certain protocols. OBJECTIVE: To optimize and compare the performance of the 3 most accurate S phase-specific labeling methods used for in situ detection and quantification of nephron progenitor and ureteric bud cell proliferation in the developing kidney, namely, 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU), 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), and proliferating cell nuclear antigen (PCNA). METHODS: Protocols for BrdU, EdU, and PCNA were optimized for fluorescence labeling on paraformaldehyde-fixed, paraffin-embedded mouse kidney tissue sections, with co-labeling of nephron progenitor cells and ureteric bud with Six2 and E-cadherin antibodies, respectively. Image processing and analysis, including quantification of proliferating cells, were carried out using free ImageJ software. RESULTS: All 3 methods detect similar ratios of nephron progenitor and ureteric bud proliferating cells. The BrdU staining protocol is the lengthiest and most complex protocol to perform, requires tissue denaturation, and is most subject to interexperimental signal variability. In contrast, bound PCNA and EdU protocols are relatively more straightforward, consistently yield clear results, and far more easily lend themselves to co-staining; however, the bound PCNA protocol requires substantive additional postexperimental analysis to distinguish the punctate nuclear PCNA staining pattern characteristic of proliferating cells. CONCLUSIONS: All 3 markers exhibit distinct advantages and disadvantages in quantifying cell proliferation in kidney progenitor populations, with EdU and PCNA protocols being favored due to greater technical ease and reproducibility of results associated with these methods.
CONTEXTE: Les cellules progénitrices de néphrons dérivées du mésenchyme métanéphrique subissent une séquence complexe d'auto-régénération et de différenciation tout au long du développement du rein pour donner naissance aux néphrons matures. La prolifération cellulaire est un indice de la dynamique des populations de cellules progénitrices. La quantification in situ précise et reproductible de la prolifération cellulaire au sein de populations de cellules progénitrices peut cependant s'avérer techniquement difficile à réaliser en raison de la complexité et de la sévérité du traitement tissulaire requis par certains protocoles. OBJECTIF: Optimiser et comparer la performance des trois plus précises méthodes de marquage spécifiques à la phase S pour détecter et quantifier in situ la prolifération des cellules progénitrices de néphrons et de bourgeons urétéraux dans le rein en développement, à savoir la 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU), la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU), et l'antigène nucléaire de prolifération cellulaire (PCNA). MÉTHODOLOGIE: Les protocoles pour BrdU, EdU et PCNA ont été optimisés pour le marquage fluorescent de coupes de tissus rénaux de souris, fixés au paraformaldéhyde et enchassés dans la paraffine, avec co-marquage des cellules progénitrices de néphrons et de bourgeons urétéraux avec les anticorps Six2 et E-cadhérine, respectivement. Le traitement et l'analyse des images, y compris la quantification des cellules en prolifération, ont été réalisés à l'aide du logiciel gratuit ImageJ. RÉSULTATS: Les trois méthodes ont détecté des ratios similaires de cellules progénitrices de néphrons et de bourgeons urétéraux en prolifération. Le protocole de coloration BrdU est le plus long et le plus complexe à effectuer. Il requiert la dénaturation des tissus et il est le plus sujet à la variabilité du signal inter-expériences. En revanche, les protocoles de liaison de PCNA et d'EdU sont relativement plus simples, donnent systématiquement des résultats clairs et se prêtent beaucoup plus facilement à la coloration conjointe. Toutefois, le protocole de liaison de PCNA requiert une analyse supplémentaire approfondie post-expérience pour distinguer le schéma de coloration ponctuée du noyau caractéristique des cellules en prolifération. CONCLUSION: Les trois méthodes ont montré des avantages et des inconvénients distincts pour la quantification de la prolifération cellulaire des populations de cellules progénitrices du rein. Les protocoles avec EdU et PCNA sont favorisés en raison de leur simplicité technique et de la reproductibilité des résultats obtenus.
