ABSTRACT
We studied the involvement of the α8 subunit of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) in olfactory learning and memory in Apis mellifera. We have previously shown, by injecting different nicotinic antagonists into the bee brain, that pharmacologically different subtypes of nAChRs are important for honeybee memory -α-bungarotoxin-sensitive receptors are necessary for memory consolidation and mecamylamine-sensitive receptors are involved in retrieval processes. Here, we took advantage of the honeybee genome sequencing and the development of a small interfering RNA (siRNA) tool to focus on the role of the α8 subunit, which has been shown to be expressed in brain areas important for olfactory learning, such as the antennal lobes and mushroom bodies. We first demonstrated the efficacy of the siRNA tool by showing a decrease of the α8 protein level at 6 h after brain injection of α8 siRNA. We then tested the general role of this subunit in olfactory conditioning, using brain systemic or localized siRNA injections in the antennal lobes or the calyces and vertical lobes of the mushroom bodies. These injections were performed at either 6 h before the learning acquisition or 6 h before the memory test. The most prominent result was that 6-h pre-test injection of siRNA in the mushroom body vertical lobes impaired memory retrieval at 24 and 48 h post-training. This indicated the importance of cholinergic extrinsic neurons and nAChRs containing the α8 subunit for this process.
Subject(s)
Insect Proteins/metabolism , Mushroom Bodies/physiology , Olfactory Perception/genetics , Protein Subunits/metabolism , RNA, Small Interfering/genetics , Receptors, Nicotinic/metabolism , Animals , Bees , Cholinergic Neurons/metabolism , Cholinergic Neurons/physiology , Conditioning, Classical , Gene Expression , Gene Knockdown Techniques , Insect Proteins/genetics , Learning , Memory , Mushroom Bodies/metabolism , Olfactory Perception/physiology , Protein Subunits/genetics , Receptors, Nicotinic/geneticsABSTRACT
A malária é uma doença de grande impacto na saúde pública, em diferentes regiões do mundo, inclusive no Brasil. O mosquito anofelino é vetor dos protozoários que causam a doença, constituindo parte fundamental na transmissão. O sistema imune dos mosquitos apresenta função essencial no que determina a competência vetorial desses insetos, sendo, portanto, alvo importante para estudos sobre vacinas de bloqueio de transmissão e de genes para o desenvolvimento de mosquitos transgênicos refratários ao plasmódio. Em Anopheles gambiae, vários genes foram descritos e caracterizados quanto à resposta contra os protozoários causadores da malária. Entre esses genes, o codificador da FBN9 (uma imunolectina da família dos fibrinogênios) e das proteínas da família Tep (Thioester containing protein) apresentaram resultados interessantes que demonstram uma resposta contra Plasmodium spp. e outros microorganismos. No entanto, os estudos sobre a imunidade dos vetores brasileiros, bem como sobre a resposta à infecção por Plasmodium vivax, são escassos. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo estudar os genes FBN9 e Tep1, por meio da amplificação, seqüenciamento, análises das seqüências e da filogenia dos genes e ainda pela quantificação da expressão destes genes em mosquitos infectados com P. vivax.
Os genes correspondentes á FBN9, e de duas proteínas da família Tep (Tep1 e TepX) foram identificados e suas seqüências parciais foram obtidas em Anopheles aquasalis, Anopheles darlingi, Anopheles albitarsis e Anopheles nuneztovari. As análises demonstraram alto grau de conservação destas proteínas entre as diferentes espécies, apresentando grande quantidade de substituições sinônimas, o que sugere que estas proteínas possuem importante função e/ou estrutura. A árvore filogenética gerada para FBN9 mostra que os anofelinos brasileiros e os anofelinos africanos fazem parte de dois agrupamentos distintos. As análises de expressão gênica demonstraram que Tep1 é 4,7 vezes mais expresso em carcaças de mosquitos infectados em relação aos controles e para TepX, apesar de não haver diferença significativa na sua expressão em carcaças de mosquitos infectados em relação ao controle, sua expressão no intestino foi 6,5 vezes maior em mosquitos infectados. Esses resultados demonstram que FBN9 e TepX possuem grandes evidências de serem importantes na resposta imune dos anofelinos brasileiros contra P.vivax. No entanto, outros estudos, como o silenciamento dessas proteínas, são essenciais para afirmações mais conclusivas
Subject(s)
Male , Female , Animals , Guinea Pigs , Mice , Anopheles/immunology , Anopheles/parasitology , Malaria, Vivax/transmission , Plasmodium vivax/parasitologyABSTRACT
A malária é uma doença de grande impacto na saúde pública, em diferentes regiões do mundo, inclusive no Brasil. O mosquito anofelino é vetor dos protozoários que causam a doença, constituindo parte fundamental na transmissão. O sistema imune dos mosquitos apresenta função essencial no que determina a competência vetorial desses insetos, sendo, portanto, alvo importante para estudos sobre vacinas de bloqueio de transmissão e de genes para o desenvolvimento de mosquitos transgênicos refratários ao plasmódio. Em Anopheles gambiae, vários genes foram descritos e caracterizados quanto à resposta contra os protozoários causadores da malária. Entre esses genes, o codificador da FBN9 (uma imunolectina da família dos fibrinogênios) e das proteínas da família Tep (Thioester containing protein) apresentaram resultados interessantes que demonstram uma resposta contra Plasmodium spp. e outros microorganismos. No entanto, os estudos sobre a imunidade dos vetores brasileiros, bem como sobre a resposta à infecção por Plasmodium vivax, são escassos. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo estudar os genes FBN9 e Tep1, por meio da amplificação, seqüenciamento, análises das seqüências e da filogenia dos genes e ainda pela quantificação da expressão destes genes em mosquitos infectados com P. vivax.
Os genes correspondentes á FBN9, e de duas proteínas da família Tep (Tep1 e TepX) foram identificados e suas seqüências parciais foram obtidas em Anopheles aquasalis, Anopheles darlingi, Anopheles albitarsis e Anopheles nuneztovari. As análises demonstraram alto grau de conservação destas proteínas entre as diferentes espécies, apresentando grande quantidade de substituições sinônimas, o que sugere que estas proteínas possuem importante função e/ou estrutura. A árvore filogenética gerada para FBN9 mostra que os anofelinos brasileiros e os anofelinos africanos fazem parte de dois agrupamentos distintos. As análises de expressão gênica demonstraram que Tep1 é 4,7 vezes mais expresso em carcaças de mosquitos infectados em relação aos controles e para TepX, apesar de não haver diferença significativa na sua expressão em carcaças de mosquitos infectados em relação ao controle, sua expressão no intestino foi 6,5 vezes maior em mosquitos infectados. Esses resultados demonstram que FBN9 e TepX possuem grandes evidências de serem importantes na resposta imune dos anofelinos brasileiros contra P.vivax. No entanto, outros estudos, como o silenciamento dessas proteínas, são essenciais para afirmações mais conclusivas
Subject(s)
Animals , Male , Female , Guinea Pigs , Mice , Anopheles/immunology , Anopheles/parasitology , Malaria, Vivax/transmission , Plasmodium vivax/parasitologyABSTRACT
The technique to generate transgenic mosquitoes requires adaptation for each target species because of aspects related to species biology, sensitivity to manipulation and rearing conditions. Here we tested different parameters on the microinjection procedure in order to obtain a transgenic Neotropical mosquito species. By using a transposon-based strategy we were able to successfully transform Aedes fluviatilis (Lutz), which can be used as an avian malaria model. These results demonstrate the usefulness of the piggyBac transposable element as a transformation vector for Neotropical mosquito species and opens up new research frontiers for South American mosquito vectors.
Subject(s)
Aedes/genetics , DNA Transposable Elements/genetics , Gene Transfer Techniques , Insect Vectors/genetics , Transformation, Genetic/genetics , Animals , Female , Genes, Insect , Germ Cells , Male , MicroinjectionsABSTRACT
The technique to generate transgenic mosquitoes requires adaptation for each target species because of aspects related to species biology, sensitivity to manipulation and rearing conditions. Here we tested different parameters on the microinjection procedure in order to obtain a transgenic Neotropical mosquito species. By using a transposon-based strategy we were able to successfully transform Aedes fluviatilis (Lutz), which can be used as an avian malaria model. These results demonstrate the usefulness of the piggyBac transposable element as a transformation vector for Neotropical mosquito species and opens up new research frontiers for South American mosquito vectors.
