Alternating flow filtration as an alternative to internal spin filter based perfusion process: Impact on productivity and product quality.

This article reports the results obtained from comparison of internal spin filter (ISF) and alternating flow filtration (ATF) as cell retention systems, regarding cell growth, volumetric perfusion rate, cell specific perfusion rate and cell productivity in the fermentation process. As expected we were able to reach higher cell densities and to achieve longer runs since ATF systems are known to be less affected by fouling. Volumetric production of the reactor using the ATF system was 50-70% higher than the production achieved using the ISF due to higher cell density and a two-fold increase in the perfusion rate. On the other hand, downstream processing performances were evaluated regarding chromatographic steps yields and productivity and quality attributes of the purified materials. Similar results were obtained for all evaluated systems. The fact that we were able to achieve a 2 working volumes (WV)/day perfusion rate using an ATF system as cell retention device allowed us to virtually double the WV of a 25 L reactor. These results constitute valuable data for the optimization of recombinant protein production in perfusion processes since a two-fold increase in the average production of a manufacturing facility could be easily achieved as long as downstream scale up is possible. © 2017 American Institute of Chemical Engineers Biotechnol. Prog., 33:1010-1014, 2017.

Establishment of a design space for biopharmaceutical purification processes using DoE.

Recent trends in the pharmaceutical sector are changing the way protein purification processes are designed and executed, moving from operating the process in a fixed point to allowing a permissible region in the operating space known as design space. This trend is driving product development to design quality into the manufacturing process (Quality by Design) and not to rely exclusively on testing quality in the product. A typical purification step has numerous operating parameters that can impact its performance. Therefore, optimization and robustness analysis in purification processes can be time-consuming since they are mainly grounded on experimental work. A valuable approach consists in the combination of an adequate risk analysis technique for selecting the relevant factors influencing process performance and the design of experiment methodology. The latter allows for many process variables which can be studied at the same time; thus, the number of tests will be reduced in comparison with the conventional approach based on trial and error. These multivariate studies permit a detailed exploration in the experimental range and lay the foundation of Quality by Design principles application. This article outlines a recommended sequence of activities toward the establishment of an expanded design space for a purification process.

Determination of robustness and optimal work conditions for a purification process of a therapeutic recombinant protein using response surface methodology.

A typical chromatographic purification step has numerous operating parameters that can impact its performance. As it is not feasible to evaluate the influence of each one, the current practice in biopharmaceutical industry is to apply risk analysis approach to identify process parameters that should be examined during process characterization. Once these parameters are identified, a response surface study can be run to help understand the relationship between critical inputs and outputs. We performed a study comprising optimization and robustness determination for a Blue-Sepharose purification step of rhEPO, a well-known therapeutic glycoprotein. Initially, risk analysis was fulfilled to identify key parameters. A small-scale model was created and qualified before its use in experimental studies, given by a Box-Behnken design with three factors. This method proved to be a very useful tool in bioprocess validation studies in which many input variables can affect product quality and safety.

Hormonal effects on unoccupied estrogen receptors in nuclei of anterior pituitary glands

Se determinaron los receptores libres nucleares en pituitarias anteriores de ratas ovariectomizadas-adrenalectomizadas luego de la extracción de los núcleos purificados con KCL 0.4 M y la posterior incubación del extracto con 2.5 nM (3H)-estradiol (E2) durante 1.5 h a 0-4-C. Se observó unión de alta afinidad y baja capacidad en ratas no tratadas y la concentración de receptor se duplicó después de la administración de E2 durante 4 días, mientras que el tratamiento agudo (60 m) no tuvo efecto. La exposición prolongada a dietilestilbestrol (3 meses) produjo una regulación negativa tanto de los receptores nucleares libres como de los totales. El tamoxifen aumentó los receptores libres nucleares, indujo el receptor progestínico en citosol e inhibió la prolactina sérica inducida por E2, pero no la estimulación estrogénica de los receptores libres nucleares. La progesterona y testosterona no tuvieron efecto sobre los sitios nucleares libres tanto basales como estimulados por E2, mientras que la dexametasona redujo los primeros pero no los últimos. Finalmente, del 33 al 36% de los receptores libres nucleares unidos a (3H)-E2 fueron retenidos en columnas de ADN-celulosa, ya sea que la incubación con el ligando se llevara a cabo a baja temperatura (0-4-C) o alta temperatura (25-C). La unión de ADN-celulosa no cambió luego del tratamiento corto con E2 pero aumentó después de 4 días de E2. Estos dados sugieren la regulación de los recptores libres nucleares para estradiol por el ligando como así también por antiestrógenos y corticoides en la pituitaria anterior. Los sitios nucleares libres podrían ser una fracción de los receptores celulares totales que estuvieran en el estado transformado y que se unieran más fuertemente a los núcleos in vivo, como lo indican los resultados de unión a ADN-celulosa in vitro (AU) &P

Hormonal effects on unoccupied estrogen receptors in nuclei of anterior pituitary glands

Se determinaron los receptores libres nucleares en pituitarias anteriores de ratas ovariectomizadas-adrenalectomizadas luego de la extracción de los núcleos purificados con KCL 0.4 M y la posterior incubación del extracto con 2.5 nM (3H)-estradiol (E2) durante 1.5 h a 0-4-C. Se observó unión de alta afinidad y baja capacidad en ratas no tratadas y la concentración de receptor se duplicó después de la administración de E2 durante 4 días, mientras que el tratamiento agudo (60 m) no tuvo efecto. La exposición prolongada a dietilestilbestrol (3 meses) produjo una regulación negativa tanto de los receptores nucleares libres como de los totales. El tamoxifen aumentó los receptores libres nucleares, indujo el receptor progestínico en citosol e inhibió la prolactina sérica inducida por E2, pero no la estimulación estrogénica de los receptores libres nucleares. La progesterona y testosterona no tuvieron efecto sobre los sitios nucleares libres tanto basales como estimulados por E2, mientras que la dexametasona redujo los primeros pero no los últimos. Finalmente, del 33 al 36% de los receptores libres nucleares unidos a (3H)-E2 fueron retenidos en columnas de ADN-celulosa, ya sea que la incubación con el ligando se llevara a cabo a baja temperatura (0-4-C) o alta temperatura (25-C). La unión de ADN-celulosa no cambió luego del tratamiento corto con E2 pero aumentó después de 4 días de E2. Estos dados sugieren la regulación de los recptores libres nucleares para estradiol por el ligando como así también por antiestrógenos y corticoides en la pituitaria anterior. Los sitios nucleares libres podrían ser una fracción de los receptores celulares totales que estuvieran en el estado transformado y que se unieran más fuertemente a los núcleos in vivo, como lo indican los resultados de unión a ADN-celulosa in vitro (AU) &P