Molecular identification of abomasal bacteria associated with genetic resistance and susceptibility to Haemonchus contortus infection in sheep / Identificação molecular de bactérias abomasais associadas à resistência e susceptibilidade a infecções por Haemonchus contortus em ovinos

The widespread occurrence of anthelmintic-resistant gastrointestinal nematodes (GINs), particularly Haemonchus contortus, in sheep production systems has magnified the need to identify and develop alternative control strategies. Strategies include the selection of genetically GIN-resistant sheep and the implementation of biological parasite control to reduce dependence on anthelmintic drugs. In this study, we aimed to establish the molecular identity of bacterial communities present in the abomasum of sheep classified as resistant or susceptible to H. contortus. Thirty-eight sheep were experimentally infected with L3 Haemonchus contortus and analyzed for fecal egg count (FEC), and hematocrit (Ht) to establish haemonchosis resistance or susceptibility. Four resistant sheep (RS) and four susceptible sheep (SS) were selected for microbial sampling and subsequent phylogenetic analysis. Molecular identification of the bacteria was based on amplification of the bacterial 16S rRNA gene, construction of a 16S rDNA clone library, and subsequent gene sequencing. Significant differences (p = 0.05) were observed in the occurrence of different phyla identified in RS and SS libraries: Firmicutes (61.4% and 37.2%, respectively), Proteobacteria (10.2% and 37.2%, respectively), Bacteroidetes (12.8% and 5.8%, respectively), and unclassified bacteria (12.8% and 17%, respectively). Differences between the proportions of bacterial communities present in the RS and SS pool samples were observed, contributing as a first step toward the assessment of the association between the gastrointestinal tract microbiota and nematode resistance in sheep.(AU)

Na produção de ovinos, a disseminação de nematódeos gastrintestinais (NGI) resistentes aos antihelmínticos, em especial Haemonchus contortus, tem levado à busca de estratégias de controle alternativo, como a seleção de animais geneticamente resistentes aos NGI e o controle biológico. Neste trabalho, buscou-se identificar molecularmente as comunidades bacterianas presentes no abomaso de animais classificados como resistentes ou susceptíveis ao H. contortus. Foram utilizados 38 ovinos para classificação em resistentes ou susceptíveis à hemoncose, por meio de infecções experimentais com L3 de H. contortus e posterior análise de variações na contagem de ovos por grama de fezes (ΔOPG) e hematócrito (ΔHt). Destes, foram selecionados para colheita de material e posterior análise filogenética, quatro ovinos resistentes (OR) e quatro susceptíveis (OS). A identificação molecular de bactérias foi realizada por técnicas moleculares a partir da amplificação do gene RNAr 16S bacteriano, construção de bibliotecas de clones de RNAr 16S e posterior sequenciamento gênico. O trabalho mostrou diferença significativa (p=0,05) na porcentagem dos filos predominantes para as bibliotecas OR e OS, respectivamente: Firmicutes (61,4% e 37,2%), Proteobacterias (10,2% e 37,2%), Bacteroidetes (12,8% e 5,8%) e Bactérias não classificadas (12,8% e 17%). Diferenças entre os pools OR e OS com relação à proporção de comunidades bacterianas presentes podem ser observadas, sendo o primeiro passo para que se possa avaliar a relação entre a microbiota do trato gastrointestinal e a resistência a parasitos.(AU)

Molecular identification of abomasal bacteria associated with genetic resistance and susceptibility to Haemonchus contortus infection in sheep / Identificação molecular de bactérias abomasais associadas à resistência e susceptibilidade a infecções por Haemonchus contortus em ovinos

The widespread occurrence of anthelmintic-resistant gastrointestinal nematodes (GINs), particularly Haemonchus contortus, in sheep production systems has magnified the need to identify and develop alternative control strategies. Strategies include the selection of genetically GIN-resistant sheep and the implementation of biological parasite control to reduce dependence on anthelmintic drugs. In this study, we aimed to establish the molecular identity of bacterial communities present in the abomasum of sheep classified as resistant or susceptible to H. contortus. Thirty-eight sheep were experimentally infected with L3 Haemonchus contortus and analyzed for fecal egg count (FEC), and hematocrit (Ht) to establish haemonchosis resistance or susceptibility. Four resistant sheep (RS) and four susceptible sheep (SS) were selected for microbial sampling and subsequent phylogenetic analysis. Molecular identification of the bacteria was based on amplification of the bacterial 16S rRNA gene, construction of a 16S rDNA clone library, and subsequent gene sequencing. Significant differences (p = 0.05) were observed in the occurrence of different phyla identified in RS and SS libraries: Firmicutes (61.4% and 37.2%, respectively), Proteobacteria (10.2% and 37.2%, respectively), Bacteroidetes (12.8% and 5.8%, respectively), and unclassified bacteria (12.8% and 17%, respectively). Differences between the proportions of bacterial communities present in the RS and SS pool samples were observed, contributing as a first step toward the assessment of the association between the gastrointestinal tract microbiota and nematode resistance in sheep.

Na produção de ovinos, a disseminação de nematódeos gastrintestinais (NGI) resistentes aos antihelmínticos, em especial Haemonchus contortus, tem levado à busca de estratégias de controle alternativo, como a seleção de animais geneticamente resistentes aos NGI e o controle biológico. Neste trabalho, buscou-se identificar molecularmente as comunidades bacterianas presentes no abomaso de animais classificados como resistentes ou susceptíveis ao H. contortus. Foram utilizados 38 ovinos para classificação em resistentes ou susceptíveis à hemoncose, por meio de infecções experimentais com L3 de H. contortus e posterior análise de variações na contagem de ovos por grama de fezes (ΔOPG) e hematócrito (ΔHt). Destes, foram selecionados para colheita de material e posterior análise filogenética, quatro ovinos resistentes (OR) e quatro susceptíveis (OS). A identificação molecular de bactérias foi realizada por técnicas moleculares a partir da amplificação do gene RNAr 16S bacteriano, construção de bibliotecas de clones de RNAr 16S e posterior sequenciamento gênico. O trabalho mostrou diferença significativa (p=0,05) na porcentagem dos filos predominantes para as bibliotecas OR e OS, respectivamente: Firmicutes (61,4% e 37,2%), Proteobacterias (10,2% e 37,2%), Bacteroidetes (12,8% e 5,8%) e Bactérias não classificadas (12,8% e 17%). Diferenças entre os pools OR e OS com relação à proporção de comunidades bacterianas presentes podem ser observadas, sendo o primeiro passo para que se possa avaliar a relação entre a microbiota do trato gastrointestinal e a resistência a parasitos.

In vitro and in vivo fertilization potential of cryopreserved spermatozoa from bull epididymides stored for up to 30 hours at ambient temperature (18 °C-20 °C).

The aims of this study were to compare the viability and in vivo and in vitro fertilization potential post-thaw sperm collected at different times postorchiectomy from bull epididymides (EP) at 18 °C to 20 °C, with those of semen collected by electroejaculation (EJ) from the same bulls. Semen samples were collected by EJ from 10 Zebu bulls and cryopreserved. A week later 20 epididymides from these bulls were obtained by orchiectomy and randomly divided into five groups (G) to be maintained at ambient temperature for 6, 12, 18, 24, and 30 hours before sperm recovery by retrograde flow. The sperm were cryopreserved, and post-thaw parameters were determined by both computer-assisted sperm analysis and morphologic analysis. In vitro fertilization of oocytes was performed to assess the cleavage rate, blastocyst rate, total number of cells, and hatching rate of embryos. The G30 sperm samples were also used for fixed time artificial insemination (FTAI) of Zebu heifers (n = 10). The results of post-thaw sperm viability showed that total and progressive motility and plasma membrane integrity were lower in sperm in which cryopreservation was delayed for 30 hours, showing a negative correlation of these parameters with delay before cryopreservation. In all groups, it was possible to obtain viable embryos, and embryos from G6 samples had more cells than the other groups. The greatest embryo production rates were observed in G6, G12 and G18 (27.2 to 32.2%) and it was significantly lower in G24 and G30 samples. For EJ, many individual variations were observed in embryo production potential between bulls. G30 samples, with only 5.2% of post-thaw progressive motility, were able to fertilize and produced a pregnancy. To the authors' knowledge, this is the first time in vitro embryos up to 8 days of development and a pregnancy after FTAI have been produced with sperm from bull epididymides that had been stored at 18 °C to 20 °C for up to 30 hours.

Dois diluentes comerciais na criopreservação de espermatozoides do epidídimo de touros / Two commercial extenders for cryopreservation of epididymal bull sperm

A recuperação e a criopreservação de espermatozoides do epidídimo constituem alternativas viáveis para a preservação de material genético de animais valiosos. O objetivo deste estudo foi comparar o desempenho de dois diluentes comerciais Botu-Bov(r) (BB) e Bovimix(r) (BV), sobre a viabilidade pós-descongelação de espermatozoides do epidídimo de touros Tabapuã (Bos taurus indicus) pós-castração. Os espermatozoides foram colhidos da cauda de 20 epidídimos utilizando a técnica de fluxo retrógrado, centrifugados e diluídos com BB ou BV para posterior criopreservação a -196°C. Após a descongelação, as amostras foram avaliadas utilizando a análise computadorizada (CASA) e por análises microscópicas para a determinação da integridade de membranas plasmáticas, acrossomal e morfologia espermática. A avaliação estatística dos dados foi realizada pela análise de variância (ANOVA) com o pós-teste de comparações múltiplas de Tukey-Kramer, com nível de significância (P 0,05). Os resultados do movimento espermático avaliado pelo CASA, não diferiram para o diluente BB e BV. Também não foi observada diferença significativa entre os grupos no percentual de espermatozoides morfologicamente deformados, defeitos de acrossoma e espermatozoides com membrana plasmática íntegra após o descongelamento. Conclui-se que ambos os diluentes (BB e BV) são eficientes e podem ser utilizados na tecnologia do congelamento de espermatozoides colhidos da cauda do epidídimo de touros, não apresentando diferença na viabilidade espermática para os parâmetros estudados.(AU)

Recovery and cryopreservation of epididymal sperm is a viable alternative for preservation of genetically valuable animals. The aim of this study was to verify and to compare the effect of two commercial extenders for conventional semen on post-thawing viability of bovine epididymal sperm. For this purpose, the spermatozoa was recovered from the tail of 20 epididymis of Tabapuã bulls (Bos Taurus indicus) using retrograde flow method. After sperm recovery, the cells were centrifuged and divided for dilution with the diluents Botu-Bov(r) (BB) or Bovimix(r) (BV) for cryopreservation at -196°C. After thawing, all samples were evaluated using computer assisted sperm analysis (CASA), and by microscopic analysis for determination of integrity of plasma and acrossomal membrane and morphology. Statistical evaluation was performed by analysis of variance (ANOVA) with post-test for multiple comparisons, the Tukey-Kramer test, with significance level (P 0.05). The results of the sperm movement for diluent BB and BV evaluated with CASA, showed no difference for both (P>0.05). There was also no difference between the percentage of deformed sperm, acrosome defects and the sperm with intact plasma membrane after thawing with BB or BV. We conclude that both extenders (BB and BV) are efficient and can be used for freezing sperm collected from the epididymis of bulls, showing no difference for all the parameters studied.(AU)

Dois diluentes comerciais na criopreservação de espermatozoides do epidídimo de touros / Two commercial extenders for cryopreservation of epididymal bull sperm

A recuperação e a criopreservação de espermatozoides do epidídimo constituem alternativas viáveis para a preservação de material genético de animais valiosos. O objetivo deste estudo foi comparar o desempenho de dois diluentes comerciais Botu-Bov(r) (BB) e Bovimix(r) (BV), sobre a viabilidade pós-descongelação de espermatozoides do epidídimo de touros Tabapuã (Bos taurus indicus) pós-castração. Os espermatozoides foram colhidos da cauda de 20 epidídimos utilizando a técnica de fluxo retrógrado, centrifugados e diluídos com BB ou BV para posterior criopreservação a -196°C. Após a descongelação, as amostras foram avaliadas utilizando a análise computadorizada (CASA) e por análises microscópicas para a determinação da integridade de membranas plasmáticas, acrossomal e morfologia espermática. A avaliação estatística dos dados foi realizada pela análise de variância (ANOVA) com o pós-teste de comparações múltiplas de Tukey-Kramer, com nível de significância (P<0,05). Os resultados do movimento espermático avaliado pelo CASA, não diferiram para o diluente BB e BV. Também não foi observada diferença significativa entre os grupos no percentual de espermatozoides morfologicamente deformados, defeitos de acrossoma e espermatozoides com membrana plasmática íntegra após o descongelamento. Conclui-se que ambos os diluentes (BB e BV) são eficientes e podem ser utilizados na tecnologia do congelamento de espermatozoides colhidos da cauda do epidídimo de touros, não apresentando diferença na viabilidade espermática para os parâmetros estudados.

Recovery and cryopreservation of epididymal sperm is a viable alternative for preservation of genetically valuable animals. The aim of this study was to verify and to compare the effect of two commercial extenders for conventional semen on post-thawing viability of bovine epididymal sperm. For this purpose, the spermatozoa was recovered from the tail of 20 epididymis of Tabapuã bulls (Bos Taurus indicus) using retrograde flow method. After sperm recovery, the cells were centrifuged and divided for dilution with the diluents Botu-Bov(r) (BB) or Bovimix(r) (BV) for cryopreservation at -196°C. After thawing, all samples were evaluated using computer assisted sperm analysis (CASA), and by microscopic analysis for determination of integrity of plasma and acrossomal membrane and morphology. Statistical evaluation was performed by analysis of variance (ANOVA) with post-test for multiple comparisons, the Tukey-Kramer test, with significance level (P<0.05). The results of the sperm movement for diluent BB and BV evaluated with CASA, showed no difference for both (P>0.05). There was also no difference between the percentage of deformed sperm, acrosome defects and the sperm with intact plasma membrane after thawing with BB or BV. We conclude that both extenders (BB and BV) are efficient and can be used for freezing sperm collected from the epididymis of bulls, showing no difference for all the parameters studied.