The presence of VEGF and Notch2 during preantral-antral follicular transition in infantile rats: Anatomical evidence and its implications.

Folliculogenesis is a process that depends on angiogenesis, in which VEGF and Notch signaling pathway members are involved. Although this pathway is present in preantral and antral follicular structures during the second stage of folliculogenesis, this association has not been described. Therefore, this study aimed to identify VEGF and Notch2 in ovary structures of infantile rats after induction of follicular development with a gonadotropin stimulus. In order to explore this possibility we analyzed rat ovary morphology from days 10-25 after birth; subsequently, the transition from preantral follicle to an antral stage was analyzed by the induction of follicular development with equine chorionic gonadotropin (eCG) and VEGF and Notch were identified in the rat ovary by fluorescence. The histological analysis revealed that the ovary of a 10-day-old rat has the highest percentage of preantral follicles and based on this a 10IU eCG dose promoted an increase in the number of antral follicles, as well as a decrease in the number of preantral follicles, related to which there was an increase in ovary weight and size. In addition, a higher concentration of circulating estradiol was observed, proliferation of granulosa cells in both follicle groups was stimulated, and the accumulation of VEGF in granulosa and theca cells and in the antral follicle oocyte was increased (p<0.05), whereas the presence of Notch2 was limited to mural granulosa cells, in granulosa cells that formed the cumulus oophorus and in the oocyte of both groups of follicles. The multiple correspondence analysis allowed us to support an association between VEGF and Notch2 during the transition from preantral to antral follicles in the ovary of an infantile rat.

Effect of ovine luteinizing hormone (oLH) charge isoforms on VEGF and cAMP production.

Although an increase in VEGF expression and synthesis in association with LH has been established; it is unknown if all LH isoforms act similarly. This study evaluated the production of cAMP and VEGF among LH isoforms in two in vitro bioassays. The LH was obtained from hypophyses and the group of isoforms was isolated by chromatofocusing. cAMP production was assessed using the in vitro bioassay of HEK-293 cells and VEGF production was evaluated in granulosa cells. Immunological activity was measured with a homologous RIA. Immunoactivity and bioactivity for each isoform were compared against a standard, by estimating the IC50 and the EC50. The basic isoforms were more immunoactive than the standard. The neutral and the moderately acidic had an immunological activity similar to the standard. The acidic isoform was the least immunoreactive. cAMP production at the EC50 dose was similar among the basic isoforms, the moderately acidic and the standard; for the neutral and the acidic, the EC50 dose was higher. It was observed that compared with the control, VEGF production at the lowest LH dose was no different in the standard and each isoform. In the intermediate dose, a positive response was caused in the standard and the neutral and basic isoforms. Although the acidic isoform showed a dose-dependent response, it was not significant relative to the control. In conclusion, the basic isoform generated the greatest cAMP and VEGF production, similar to the reference standard, and the acidic the smallest.

Reproductive axis function and gonadotropin microheterogeneity in a male rat model of diet-induced obesity.

Obesity causes complex metabolic and endocrine changes that may lead to adverse outcomes, including hypogonadism. We herein studied the reproductive axis function in male rats under a high-fat diet and analyzed the impact of changes in glycosylation of pituitary LH on the bioactivity of this gonadotropin. Rats were fed with a diet enriched in saturated fat (20% of total calories) and euthanized on days 90 or 180 of diet. Long-term (180 days), high-fat feeding rats exhibited a metabolic profile compatible with insulin resistance and metabolic syndrome; they concomitantly showed decreased intrapituitary and serum LH concentrations, low serum testosterone levels, and elevated serum 17beta-estradiol concentrations. A fall in biological to immunological ratio of intrapituitary LH was detected in 180 days control diet-treated rats but not in high-fat-fed animals, as assessed by a homologous in vitro bioassay. Chromatofocusing of pituitary extracts yielded multiple LH charge isoforms; a trend towards decreased abundance of more basic isoforms (pH 9.99-9.0) was apparent in rats fed with the control diet for 180 days but not in those that were fed the diet enriched in saturated fat. It is concluded that long-term high-fat feeding alters the function of the pituitary-testicular axis, resulting in hypogonadotropic hypogonadism. The alterations in LH function found in these animals might be subserved by changes in hypothalamic GnRH output and/or sustained gonadotrope exposure to an altered sex steroid hormone milieu, representing a distinctly different regulatory mechanism whereby the pituitary attempts to counterbalance the effects of long-term obesity on reproductive function.

Pituitary-testicular axis function, biological to immunological ratio and charge isoform distribution of pituitary LH in male rats with experimental diabetes.

Men with insulinopenic diabetes mellitus frequently present hypogonadism and exhibit circulating luteinizing hormone (LH) molecules with increased biological activity. To further study this latter issue, we analyzed the pattern of isoform distribution and the impact of changes in terminal glycosylation of pituitary LH on the bioactivity of this gonadotropin in experimental diabetes. Adult male rats were treated with streptozotocin or vehicle and euthanized on days 30, 60, or 90 posttreatment. All diabetic groups exhibited a significant decrease in serum insulin and testosterone levels as well as in sperm count; serum gonadotropins and 17beta-estradiol decreased only after 90 days of insulinopenia. Both the immunoreactive concentrations and the biological to immunological ratio of intrapituitary LH significantly increased in all experimental groups, as assessed by an in vitro homologous bioassay in HEK-293 cells expressing a recombinant LH receptor. Chromatofocusing of pituitary extracts revealed the presence of multiple LH charge isoforms; the pH distribution profile of LH in diabetic and control rats was indistinguishable on days 30 and 60 posttreatment. By contrast, the abundance of more basic isoforms (pH 9.99-9.0) decreased and that of isoforms with pH values 8.99-8.0 increased in rats with long-standing diabetes compared to controls. It is concluded that experimental diabetes alters the function of the pituitary-testicular axis, resulting in reduced sex steroids levels and hypogonadotropism. Long-standing insulinopenia leads to a paradoxical accumulation of intrapituitary LH molecules enriched in bioactivity with altered terminal glycosylation, which are apparently subserved by distinct mechanisms involving altered hypothalamic and/or gonadal inputs on the gonadotrope.

Comparación de dos fuentes biológicas para producir anticuerpos destinados al desarrollo de métodos de radioinmunoanálisis para determinar los niveles plasmáticos de testosterona / Comparison between two different antibody sources for the development of radioimmunoassays to measure plasmatic levels of testosterone

En el presente trabajo se compararon el suero de conejo y la yema de huevo como fuentes biológicas de anticuerpos antitestoterona para su uso en métodos de radioinmunoanálisis (RIA). Los resultados indican que la yema de huevo de gallinas inmunizadas no es una fuente adecuada de anticuerpos antitestosterona, ya que aparentemente dichos anticuerpos intervienen en el proceso del desarrollo folicular u ovulación, inhibiendo la postura e impidiéndose su recuperación. Asimismo, en el caso del suero de conejos, fue posible obtener y purificar anticuerpos antitestosterona con los cuales se desarrolló un RIA de fase líquida para medir los niveles plasmáticos de testosterona en diferentes especies animales. Los anticuerpos mostraron alta especificidad, y presentaron una reacción cruzada de 5.84 por ciento con dihidrotestosterona y 0.72 por ciento con androstenediona, estradiol y 17-hidroxiprogesterona. La sensibilidad al 90 por ciento de unión fue de 39.6 pg/ml. La recuperación del sistema fue de 90.5 por ciento con el estándar medio y 95.8 por ciento con el bajo. El rendimiento final del anticuerpo correspondió a 126.083 mg, que sirven para analizar 1.6 x 105 muestras. Se concluye que la yema de huevo no puede ser utilizada como una alternativa al suero de conejos para la producción de anticuerpos antitestosterona, a diferencia de lo que ocurre con otras hormonas esteroides.

Desarrollo de un método de radioinmunoanálisis para cortisol, utilizando anticuerpos obtenidos y purificados de la yema de huevo de gallinas inmunizadas / A radioimmunoassay method developed with antibodies purified from the yolk of immunized hen eggs

Se indujeron anticuerpos anticortisol en gallinas de postura, para lo cual se realizó una primera aplicación de 1 mg de cortisol conjugado con albúmina sérica bovina (BSA) y mezclado con adyuvante completo de Freund y solución salina fisiológica; posteriormente se realizaron seis aplicaciones más de 0.5 mg del mismo inmunógeno, los cuales se aplicaron a intervalos de 15 días. Se encontró en suero un título promedio, durante el periodo de colección del huevo, de 39.4 por ciento en una dilución de trabajo 1:1000. Los anticuerpos anticortisol se recuperaron y purificaron a partir de la yema de huevo y con ellos se desarrolló la pueba de radioinmunoanálisis (RIA) de fase líquida. Los anticuerpos de la yema mostraron alta especificidad para el cortisol respecto de otros esteroides (reacción cruzada menora 0.1 por ciento con androstenediona, estradiol, 17-hidroxiprogesterona y testosterona), así como una sensibilidad de 339 pg/ml. La precisión del RIA fue adecuada (C.V intensayo menor a 15 por ciento), al igual que la recuperación del sistema. El rendimiento fue de 594 552.63 mg de proteína que sirven para procesar 95 000 000 tubos. Se concluye que la yema de huevo de gallinas inmunizadas es una efectiva fuente de anticuerpos anticortisol, la cual puede ser utilizada como una alternativa al suero de conejos

Estandarización de un radioinmunoanálisis (RIA) para hormona de crecimiento bovina (bGH) y validación en plasma de vacas Holstein / A radioimmunoassay (RIA) standardization for bovine growth hormone (bGH) and their validation in plasma of Holstein cows

La hormona de crecimiento (GH) purificada a partir de adenohipófisis bovinas (bGH) y su antisuero obtenido en conejos, se utilizaron para desarrollar un radioinmunoanálisis (RIA) homólogo y específico. El antisuero como segundo anticuerpo. La bGH se iodizó por el método de la Cloramina T con una actividad específica de 93 µCi/µg. Cantidades crecientes de plasma bovino desplazaron paralelamente a la curva patrón cuya linearidad estuvo entre 1.31 y 39.4 ng/ml. La recuperación de cantidades conocidas de bGH añadidas a plasma bovino fue de 98.5 por ciento. El coeficiente de variación intra e interensayo fue menor a 5.1 por ciento y 8.3 por ciento respectivamente. Otras hormonas adenohipofisarias no mostraron reacciones cruzadas. Con este procedimiento se determinaron concentraciones plasmáticas de GH a cuatro vacas Holstein a la 5 y 14 semanas posparto. En cada periodo se tomaron muestras de sangre cada treinta minutos durante 24 horas a través de un catéter colocado en la vena yugular. Las muestras individuales mostraron un coeficiente de variación durante el día entre 25 por ciento y 65 por ciento. Las concentraciones de GH en plasma fueron superiores (P < 0.001) a las catorce semanas (7.80 ng/ml) que a las cinco semanas posparto (6.00 ng/ml). En virtud de que estos animales se encontraban en condiciones de pastoreo con limitada ración rica en energía, es posible que todavía a las catorce semanas de lactancia se hayan movilizado reservas corporales para favorecer la producción de leche

Obtención, purificación y caracterización de dos formas de hormona luteinizante de la adenohipófisis caprina (gLH) / Obtention, purification and characterization of two forms of caprine luteinizing hormone from adenohypophsis (gLH)

Se describe la obtención, purificación y caracterización de dos proteínas hipofisiarias de origen caprino con carga eléctrica diferente y con características de hormona luteinizante (LH). La fracción no retenida en la cromatografía de intercambio catiónico (CM-celulosa) designada CM-lab y la correspondiente al segundo pico de dicha cromatografía (CM-2ab), se repurificaron en una cromatografía de intercambio aniónico (DEAE-celulosa) en condiciones idénticas, para obtener LH-I (CM-lab-DEAE-la) con un rendimiento de 76 mg/kg de adenohipófisis, y a la LH-II (CM2ab-DEAE-lb) con 15 mg/kg. La diferencia de carga de cada proteína se determinó por su movilidad relativa (Rf) mediante una electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) en condiciones nativas. La LH-I mostró un Rf de 0.09 (banda mayoritaria) y 0.415, mientras la LH-II presentó 2 bandas de tipo catiónico con un Rf de 0.14, 0.19 (banda mayoritaria). La determinación del peso molecular relativo de LH-I y LH-II, se llevo a cabo por medio de una electroforesis en geles de poliacilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE). En condiciones no reductoras (NR), ambas proteínas presentaron un peso molecular relativo de 36.5 kilodaltones (KDa) correspondiente a la forma monomérica, semejante a los estándares NIDDK-oLH-26 y USDA-bLH5, mientras que en presencia de 2ß-mercaptoetanol (condiciones reducidas), las proteínas presentaron un peso molecular de 22.4 y 20.2 KDa. El análisis por inmunotransferencia (Western-blot) en condiciones NR utilizando el anti-oLH (CSU-204), permitió identificar bandas inmunorreactivas de peso molecular de 50,43, 36.5 (mayoritaria), y 22.4 KDa, tanto en los estándares como en las fracciones obtenidas en este estudio. La potencia biológica realizada en un bioensayo in vivo 3 + 3 balanceado fue de 1.03 UI/mg para la LH-I. y de 0.65 UI/mg para la LH-II con intervalos de confianza de 95 por ciento. Su actividad inmunológica se determinó con un radioinmunoensayo (RIA) homólogo de LH caprina, a la dosis esperada del 50 por ciento (ED 50). Los resultados fueron de 1.7 ng/ml y 3.5 ng/ml para LH-I y LH-II respectivamante. Se concluye que esta técnica permite la obtención de dos proteínas con carga eléctrica diferente, con actividad biológica e inmunológica de LH, y con peso molecular idéntico

Determinación de la hormona luteinizante con un radioinmunoanálisis (RIA) homólogo en cabras estimuladas con diferentes dosis de hormona liberadora de las gonadotropinas (GnRH) / Determination o luteinizing hormone with homologous raioimmunoassay (RIA) in goats stimulated with various doses of gonadotrophin liberating hormone (GnRH)

El presente estudio informa la validación clínica del RIA homológo de LH en cabras mestizas con estro inducido y estimuladas con dosis únicas de GNRH. Se trabajó con 24 cabras distribuidas al azar en cinco grupos. A los grupos del I al IV (n5) se les colocó esponjas con acetaro de fluorogestona (FGA) a dosis de 45 mg/animal, durante nueve días, no así al V (n4), pues se le mantuvo como testigo. Después de 24 horas de retiradas las esponjas los grupos I, II y III, se estimularon por vía intravenosa con 2, 4 y 8 µg de GnRH respectivamente, a los grupos IV y V se les administró solución salina. El muestreo se realizó cada 15 minutos, durante un periodo de cinco horas (2 h antes del estímulo con GnRH o solución salina y 3 h después). Los niveles circulantes de LH se determinaron con un sistema de RIA homólogo en fase líquida con segundo anticuerpo como sistema de separación. El grupo I presentó un pico de LH de 21.4 ñ 7.4 ng/mL; el grupo II de 13.4 ñ 3.16 ng/mL, ambos con una P<0.05 con respecto al grupo V, el cual mostró un valor promedio de LH de 4.72 ñ 0.28 ng/mL; el grupo III presentó un pico de 11.4 ñ 8.60 ng/mL sin que resultara significativo; en el grupo IV no se detectaron niveles de LH. Ni un solo animal mostró niveles de progesterona durante 21 días posteriores al estímulo con GnRH, con base en lo anterior se sugiere que los picos de LH detectados durante el experimento no fueron preovularotios