Ensayo de neutralización in vitro de aplicación en la evaluación de inmunógenos contra la hepatitis A, obtenidos mediante la tecnología de expresión en fagos filamentosos / In vitro neutralization assay to evaluate new hepatitis A vaccine candidates

La inmunidad contra el virus de la hepatitis A (VHA) se debe en primera instancia a la inducción de anticuerpos neutralizantes. Disponer de ensayos de neutralización es indispensable para evaluar nuevos candidatos vacunales contra este patógeno. En el presente trabajo se desarrolló un ensayo de neutralización in vitro que permitió evaluar la inmunogenicidad de mimotopos del VHA obtenidos mediante la tecnología de expresión en fagos al ser inmunizados ratones Balb/c. Diferentes diluciones de anticuerpos se incubaron con 10³ o 10² Dosis Infecciosas en Cultivo de Tejidos 50 por ciento (DICT50) del clon citopàtico HM175/18f de VHA, y se inocularon en placas con células FRhK4. Después de 7 días de incubación el título neutralizante se determinó como el recíproco de la dilución del suero capaz de reducir la multiplicación viral al 50 por ciento. Tanto 10³ como 10² DICT50 fueron neutralizadas por el anticuerpo monoclonal 7E7 y los sueros humanos (A12 y A31) positivos a anticuerpos anti-VHA. Los controles negativos del ensayo no neutralizaron al virus. Los títulos neutralizantes de los sueros de ratones inmunizados con fagos portadores de mimotopos de VHA oscilaron entre 4 y 16, mientras que los sueros preinmunes y los de ratones inmunizados con fago salvaje M13 no neutralizaron la infectividad viral. Este ensayo de neutralización resultó adecuado para la evaluación de los inmunógenos propuestos(AU)

Immunity to hepatitis A virus (HAV) is in first instance due to neutralizing antibodies. Neutralization assays are essential to evaluate new candidate vaccines against this pathogen. In this paper, an in vitro neutralization assay to evaluate HAV vaccine candidates using phage-display technology is described. 10³ and 10² DICT50 of HAV were incubated with different antibodies preparations and were inoculated onto plates with FRhK4 cells. After seven days of incubation, the neutralizing titer was determined as reciprocal of the serum dilution reducing HAV growth (inhibition of CPE) by 50 percent. 10³ and 10² DICT50 were neutralized by 7E7 anti-HAV monoclonal antibody and anti-VHA positive human sera (A12 and A31). Negative controls of the assay did not neutralize viral infectivity. Sera from mice immunized with phages displaying VHA mimotopes had neutralizing titers from 4-16. Neither negative control nor pre-immune and sera from mice immunized with M13 wild type phage neutralized HAV. A simple and faster in vitro neutralization assay was developed to evaluate new HAV vaccine candidates(AU)

Identification of Dengue-specific B-Cell Epitopes by Phage-display Random Peptide Library.

BACKGROUND: Dengue is the most important human viral disease transmitted by arthropod vectors. The availability of random peptide libraries (RPL) displayed on phage has provided a powerful tool for selecting sequences that mimic epitopes from microorganisms that are useful for diagnostic and vaccine development purposes. In this paper, we describe peptides that resemble the antigenic structure of B-cell epitopes of dengue virus identified from a phage-peptide library using human sera containing polyclonal antibodies against dengue virus. MATERIALS AND METHODS: Eighteen phage clones were isolated from the phage-display peptide library, J404, by affinity selection using human antisera against dengue virus type 3. These clones were tested for reactivity by ELISA with a panel of hyperimmune ascitic fluids (HAFs) containing antibodies either against all four dengue serotypes, West Nile virus (WNV) or Eastern equine encephalitis virus (EEEV) with control ascitic fluid (NAF) used as a negative control. RESULTS: Eight clones were recognized by HAFs against the four dengue serotypes, of which four significantly inhibited binding of anti-dengue antibodies to the virus. Two peptides with similar sequences to regions of NS3 and NS4B non-structural dengue virus proteins were identified. CONCLUSION: Our results suggest that these peptides could be used for the development of diagnostic tools for the detection of dengue virus infection and for a potential vaccine against this pathogen.

Influenza: vacunas clásicas y novedosas a las puertas de otra pandemia / Influenza. Classic and novel vaccines on the verge of another pandemic

Los virus de la influenza A, además del hombre, infectan otros mamíferos y una gran variedad de especies de aves. Desde 1997 se sabe que cepas aviares son capaces de infectar al hombre provocando una enfermedad generalmente leve. El brote actual de gripe aviar H5N1 en humanos ha puesto en alerta a la comunidad científica internacional, no solo por su elevada mortalidad sino por su potencialidad en la generación de una nueva pandemia. Las autoridades sanitarias han puesto en marcha un amplio programa para la preparación ante esta contingencia, que abarca diferentes campos, desde el diagnóstico y la detección precoz de los brotes tanto en animales como en humanos, la caracterización sistemática de las cepas circulantes, el sacrificio de aves infectadas, la producción masiva de antivirales y por supuesto el desarrollo y producción a gran escala de vacunas eficaces. En este último tema se trabaja intensamente tanto en el mejoramiento de las vacunas ya existentes como en la búsqueda de alternativas basadas en tecnologías denueva generación(AU)

Vacunas contra el virus dengue: desarrollo histórico / Vaccines against dengue virus: History

La Fiebre del Dengue (FD) y la Fiebre Hemorrágica del Dengue (FHD) han emergido como la principal enfermedad viral trasmitida por artrópodos que afecta al hombre. Las características de la enfermendad, la ausencia de drogas antivirales contra la misma, el incremento en el número de enfermos, de países afectados y la dificultad para el control del vector han convertido el desarrollo de vacunas contra el dengue en una prioridad para la salud pública mundial(AU)

Ensayo in vitro para detectar la presencia de agentes / adventicios en un banco de células de trabajo / In vitro assay to determine the presence of adventitious agents in a Working Cell Bank

Actualmente las colecciones de cultivos de tejidos son consideradas valiosas fuentes de material biológico parala investigación, diagnóstico y producción, sin embargo se hacen realmente útiles cuando las mismas están bien organizadas, caracterizadas y manipuladas como Bancos Celulares Maestros y de Trabajo, en dependencia de la dirección de los objetivos de trabajo. Las agencias reguladoras en todo el mundo consideran el establecimiento de Bancos Celulares Maestros y de Trabajo siguiendo las Buenas Prácticas de Fabricación vigentes y los “Puntos a Considerar en la Caracterización de Líneas Celulares utilizadas en la Producción de Biológicos”. El objetivo de este trabajo fue determinar que un Banco Celular de Trabajo (BCT) obtenido en nuestro laboratorio estaba libre de agentes adventicios, para lo cual se realizó la observación a través del microscopio óptico y electrónico para visualizar morfología y presencia de retrovirus, se verificó la ausencia de contaminación bacteriana, fúngica y de micoplasmas; además se buscó presencia de otros agentes adventicios utilizando tres sistemas de cultivo celular. La morfología de las células fue seudofibroblástica como está reportado para esta línea, el Banco Celular está exento de bacterias, hongos y micoplasmas y los resultados de la prueba de agentes extraños fueron negativos, la observación al microscopio electrónico no reveló partículas tipo A y tipo C de retrovirus. Como conclusión podemos decir que el Banco Celular de Trabajo cumple con las regulaciones establecidas y pudiera ser empleado en la producción de vacunas veterinarias(AU)

Aplicación de la técnica de inmunoperoxidasa para la / titulación de cepas del virus Dengue 1 / Use of the immunoperoxidase technique for the titration of a Dengue 1 virus strain

La aplicación de la técnica de inmunoperoxidasa para titular virus Dengue ha permitido eliminar algunas de lasdesventajas que presenta, para este mismo fin, la técnica de formación de placas en cultivos celulares,catalogada como un método fastidioso debido a los múltiples factores que influyen en la formación de las placas. En la literatura consultada se reporta la disminución del tiempo para la obtención de los resultados como la principal ventaja de la primera, pero no datos sobre su precisión. Teniendo esto en cuenta nos propusimos aplicar dicha técnica para titular virus Dengue 1. Se siguió el procedimiento descrito para realizar la inmunoperoxidasa modificando el tiempo de fijación de las células infectadas de 5, 7 y 10 días y el bloqueo con TSF-Tween 20- SAB 1(por ciento) durante una hora. La dilución de trabajo para el suero humano utilizado fue de 1/500 y para el líquido ascítico hiperinmune de ratón, contra Dengue 1 fue de 1/100; para los conjugados peroxidasa anti humano y anti ratón empleados, resultaron útiles diluciones de 1/100 y 1/200 para el primero y 1/500 y 1/1000 para el segundo. Se evidenciaron los focos de infección viral, al 7° y 10° días, pero no al 5º. Los títulos virales obtenidos por dos operadores presentaron un Coeficiente de Variación < 30(por ciento). Se seleccionó el 7º día para titular el virus, lográndose reducir el tiempo requerido para obtener los resultados con la técnica de placas.No hubo diferencias significativas entre los títulos virales calculados por ambas técnicas(AU)