Producción de plásmidos recombinantes para su uso como controles de la técnica RT-PCR para el diagnósticode los virus Chikungunya y Zika / Production of recombinant plasmids as controls of diagnosis technique (RTPCR) of Chikungunya and Zika viruses

El diagnóstico molecular de arbovirus es indispensable para identificar agentes etiológicos, particularmente en zonas endémicas para al menos uno de ellos. Estas deben ser validadas con controles positivos, los cuales están clásicamente representados por virus vivos, cuya obtención puede ser riesgosa, laboriosa y costosa. El objetivo de este estudio fue producir plásmidos recombinantes para su uso como controles positivos en la validación de la técnica RT-PCR para el diagnóstico de los virus Chikungunya (CHIKV) y Zika (ZIKV). A partir de los ARN extraídos de los virus [CHIKV (LARD809-GC) y ZIKV (MR766)] se obtuvieron por RT-PCR fragmentos parciales de ADN correspondientes a secuencias nucleotídicas de los genes E1 y NS5 de los virus Chikungunya y Zika, respectivamente, para serclonados en el plásmido comercial pGEM®-T Easy. La clonación se confirmó mediante PCR de colonias y PCR de ADN plasmídicos extraídos a partir de las colonias recombinantes. Se logró la producción de dos plásmidos recombinantes CHIKV-E1/pGEM®-T Easy y ZIKV-NS5192/pGEM®-T Easy con cada una de las secuencias especificadas, para su uso en la validación y control de las técnicas moleculares descritas en este reporte, para el diagnóstico de agentes virales CHIKV y ZIKV, evitando la manipulación de cultivos celulares y garantizando una fuente confiable de controles positivos(AU)

The use of molecular techniques for the viral diagnosis requires the use of positive controls.Classically, the controls are live viruses, whose manipulation may be risky, laborious and expensive. The objective of this study was produced recombinant plasmids to obtain cloned sequences of Chikungunya (CHIKV) and Zika (ZIKV) virus for their use as controls in the specificdiagnostic by RT-PCR. DNA fragments were obtained fromRNA [CHIKV (LARD809-GC) and ZIKV (MR766)] using specific primers to amplify the nucleotide sequences from fragments of Envelope 1 protein (E1) of CHIKV and Non Structural 5 protein (NS5) of ZIKV genomes. The 548 bp (CHIKV) and 192 bp(ZIKV) bands were purified from agarose gel and ligations were performed with the cloning vector pGEM®-T Easy. The Escherichia coli XL1-Blue MRF` cells were transformed with the ligation mixture, the recombinant colonies were identified by colony PCR using the specific primers to the specific viral agent. One recombinant colony from CHIKV and six recombinant colonies from ZIKV were obtained from which plasmidic DNAs was extracted. The plasmidic DNAs were used as reaction controls in CHIKV and ZIKV RT-PCR, obtaining the characteristic bands. The cloning of the sequences was successful to produce the recombinant plasmids (CHIKV-E1/pGEM®-T Easy y ZIKV-NS5192/pGEM®-T Easy) to use in the validation of RT-PCR techniques(AU)

Molecular diagnosis of dengue virus infections in samples collected on filter paper / Diagnóstico molecular de infecciones por virus Dengue en muestras colectadas en papel de filtro

Dengue virus infections (DENV) are a severe public health problem due to the high rates of morbidity and mortality involved, and the fact that no clinical treatment or vaccines are available. In order to strengthen the laboratory diagnosis for surveillance systems in tropical countries with low resources, we report an optimized method using filter paper for blood spotting and subsequent molecular diagnosis of DENV serotypes. Control strains of all serotypes, as well as 35 whole blood patient samples dispensed on filter paper, were stored at room temperature for as long as 36 months. RT-PCR of 5’UTR-C fragment was amplified through adapted protocols to diagnose all dengue serotypes. Results showed amplification for all four viral serotypes, including control viral strains and 88.6 % of the samples. These results allowed determining the utility of filter paper for the preservation of samples regularly obtained from patients with clinical suspicion of dengue in settings where low resources do not permit an immediate analysis of the samples. Likewise, this study evidence the possibility of molecular diagnosis of DENV from multiple areas of the world where there are no laboratories with the capacity to confirm DENV cases.

Las infecciones por virus Dengue (DENV) representan un grave problema de salud pública debido a las altas tasas de morbilidad y mortalidad que causan, además no cuentan con tratamiento clínico específico, ni vacuna. Con el fin de reforzar el diagnóstico de laboratorio para los sistemas de vigilancia epidemiológica en países tropicales con recursos económicos limitados, se optimizó una metodología utilizando papel de filtro para la recolección de muestras y el subsiguiente diagnóstico molecular de los serotipos de DENV. Se emplearon cepas controles correspondientes a todos los serotipos virales, así como 35 muestras de sangre total dispensadas en papel de filtro que fueron mantenidas a temperatura ambiente por 36 meses. Las muestras fueron analizadas mediante RT-PCR para la amplificación de la región del genoma correspondiente a 5´UTR-C de los DENV. Los resultados mostraron la amplificación de los mencionados fragmentos en 88,6% de las muestras analizadas, así como de las cepas controles. Estos resultados evidenciaron la utilidad del papel de filtro para conservación de muestras obtenidas de pacientes con sospecha clínica de dengue ubicados en zonas donde no es posible realizar análisis de laboratorio de forma inmediata, así como su uso para el diagnóstico molecular. De este modo se reforzaría la vigilancia en áreas, donde no hay laboratorios con capacidad para confirmar casos de DENV.