Neuroligin 1 induces blood vessel maturation by cooperating with the α6 integrin.

The synaptic protein Neuroligin 1 (NLGN1), a cell adhesion molecule, is critical for the formation and consolidation of synaptic connectivity and is involved in vascular development. The mechanism through which NLGN1 acts, especially in vascular cells, is unknown. Here, we aimed at deepening our knowledge on the cellular activities and molecular pathways exploited by endothelial NLGN1 both in vitro and in vivo. We analyzed the phenotypic consequences of NLGN1 expression modulation in endothelial cells through in vitro angiogenesis assays and the mouse postnatal retinal angiogenesis model. We demonstrate that NLGN1, whereas not affecting endothelial cell proliferation or migration, modulates cell adhesion to the vessel stabilizing protein laminin through cooperation with the α6 integrin, a specific laminin receptor. Finally, we show that in vivo, NLGN1 and α6 integrin preferentially colocalize in the mature retinal vessels, whereas NLGN1 deletion causes an aberrant VE-cadherin, laminin and α6 integrin distribution in vessels, along with significant structural defects in the vascular tree.

Apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain inflammasomes mediate IL-1ß response and host resistance to Trypanosoma cruzi infection.

The innate immune response to Trypanosoma cruzi infection comprises several pattern recognition receptors (PRRs), including TLR-2, -4, -7, and -9, as well as the cytosolic receptor Nod1. However, there are additional PRRs that account for the host immune responses to T. cruzi. In this context, the nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors (NLRs) that activate the inflammasomes are candidate receptors that deserve renewed investigation. Following pathogen infection, NLRs form large molecular platforms, termed inflammasomes, which activate caspase-1 and induce the production of active IL-1ß and IL-18. In this study, we evaluated the involvement of inflammasomes in T. cruzi infection and demonstrated that apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain (ASC) inflammasomes, including NLR family, pyrin domain-containing 3 (NLRP3), but not NLR family, caspase recruitment domain-containing 4 or NLR family, pyrin domain-containing 6, are required for triggering the activation of caspase-1 and the secretion of IL-1ß. The mechanism by which T. cruzi mediates the activation of the ASC/NLRP3 pathway involves K⁺ efflux, lysosomal acidification, reactive oxygen species generation, and lysosomal damage. We also demonstrate that despite normal IFN-γ production in the heart, ASC⁻/⁻ and caspase-1⁻/⁻ infected mice exhibit a higher incidence of mortality, cardiac parasitism, and heart inflammation. These data suggest that ASC inflammasomes are critical determinants of host resistance to infection with T. cruzi.

Expressão da proteína recombinante RasGEF1b: um novo fator de troca de nucleotídeos guanina associado à proteína Ras induzido pelo Trypanosoma cruzi

RasGEF1b é um fator de troca de nucleotídeos guanina (GEF) hipotético e altamente conservado. Esse gene contém um domínio RASGEFN com um motivo zíper de leucina e um domínio RASGEF com três sítios de localização nuclear. A expressão do mRNA do RasGEF1b em macrófagos é induzida por diferentes agonistas de receptores do tipo Toll (TLRs), tais como LPS (TLR4), GPI-mucina (TLR2) e Poli I:C (TLR3). A fim de expressar a proteína recombinante, nós clonamos o cDNA do RasGEF1b no vetor pQE-30, utilizado para transformar bactérias E. coli (XL1-Blue). A His-RasGEF1b expressa em bactérias foi purificada utilizando tampão com alto conteúdo de uréia, seguido por cromatografia de afinidade utilizando resina carregada com níquel. A expressão da proteína foi confirmada em gel 2D, análise por espectometria de massa e Western blotting utilizando um anticorpo monoclonal anti-His. Além disso, o cDNA do RasGEF1b foi inserido em um plasmídeo que permite a fusão do epitopo FLAG (pFLAGCMV2) com a proteína RasGEF1b. O pFLAGCMV2 codificando o cDNA do RasGEF1b foi utilizado para transfectar células HEK293T e a expressão protéica foi avaliada com gel 2D gel e Western blotting utilizando um anticorpo monoclonal anti-FLAG. A proteína reconhecida pelo anti-FLAG mostrou um peso molecular aparente de 56 KDa e ponto isoelétrico de 7,25. Utilizando a técnica de centrifugação diferencial e anticorpos monoclonais para as proteínas específicas das diferentes frações subcelulares, nós demonstramos que a proteína FLAG-RasGEF1b estava presente principalmente nas frações de núcleo e de membranas pesadas. Através do alinhamento entre seqüências da RasGEF1b de diferentes espécies filogeneticamente distintas vimos que esta proteína é altamente conservada com similaridade de 57 por cento a 97 por cento em relação à RasGEF1b murina.

Expressão da proteína recombinante RasGEF1b: um novo fator de troca de nucleotídeos guanina associado à proteína Ras induzido pelo Trypanosoma cruzi / Expression of the recombinant protein RasGEF1b: a new factor of guanina exchange of nucleotídeos associate to induced the Ras protein for the Trypanosoma cruzi

RasGEF1b é um fator de troca de nucleotídeos guanina (GEF) hipotético e altamente conservado. Esse gene contém um domínio RASGEFN com um motivo zíper de leucina e um domínio RASGEF com três sítios de localização nuclear. A expressão do mRNA do RasGEF1b em macrófagos é induzida por diferentes agonistas de receptores do tipo Toll (TLRs), tais como LPS (TLR4), GPI-mucina (TLR2) e Poli I:C (TLR3). A fim de expressar a proteína recombinante, nós clonamos o cDNA do RasGEF1b no vetor pQE-30, utilizado para transformar bactérias E. coli (XL1-Blue). A His-RasGEF1b expressa em bactérias foi purificada utilizando tampão com alto conteúdo de uréia, seguido por cromatografia de afinidade utilizando resina carregada com níquel. A expressão da proteína foi confirmada em gel 2D, análise por espectometria de massa e Western blotting utilizando um anticorpo monoclonal anti-His. Além disso, o cDNA do RasGEF1b foi inserido em um plasmídeo que permite a fusão do epitopo FLAG (pFLAGCMV2) com a proteína RasGEF1b. O pFLAGCMV2 codificando o cDNA do RasGEF1b foi utilizado para transfectar células HEK293T e a expressão protéica foi avaliada com gel 2D gel e Western blotting utilizando um anticorpo monoclonal anti-FLAG. A proteína reconhecida pelo anti-FLAG mostrou um peso molecular aparente de 56 KDa e ponto isoelétrico de 7,25. Utilizando a técnica de centrifugação diferencial e anticorpos monoclonais para as proteínas específicas das diferentes frações subcelulares, nós demonstramos que a proteína FLAG-RasGEF1b estava presente principalmente nas frações de núcleo e de membranas pesadas. Através do alinhamento entre seqüências da RasGEF1b de diferentes espécies filogeneticamente distintas vimos que esta proteína é altamente conservada com similaridade de 57 por cento a 97 por cento em relação à RasGEF1b murina.