Implementación de un método in house para el tamizaje de los Virus de la Hepatitis C e Inmunodeficiencia Humana en donantes de sangre: resultados / Implementation of an in-house method for screening for Hepatitis C and Human Immunodeficiency Virus in blood donors: results

La implementación de técnicas de amplificación de ácidos nucleicos (NAT) para la detección de Virus de Hepatitis C (VHC) y Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) en el tamizaje de donantes de sangre permite acortar los períodos ventana para los ensayos utilizados en la detección de antígenos y/o anticuerpos, identificando donaciones infectivas y evitando su transfusión. Todos los usuarios de NAT deben proceder a su validación para investigar si los procedimientos involucrados cumplen y garantizan confiabilidad en la reducción del período ventana en unidades de hemocomponentes factibles de ser transfundidas. El objetivo de este trabajo fue mostrar los resultados obtenidos de la implementación de técnica NAT in house validadas frente a estándares internacionales para la detección de VHC y VIH en donantes de sangre. Los resultados fueron analizados con el software Probit analysis programs. Para un 95% de positividad, el límite de detección fue de 98,50 Ul/ml para VHC y 294, 84 Ul/ml para VIH. La especificidad fue del 100% y los procedimientos presentaron robustez. La validación de técnicas de PCR in house permite demostrar que, por sensibilidad y especificidad, son una alternativa válida y aplicable en el tamizaje de donantes de sangre.

The technical implementation of nucleic acid amplification (NAT) for detecting hepatitis C virus (HCV) and Human Immunodeficiency Virus (HIV) in blood donors screening can shorten the window periods of tests used in the detection antigen and/or antibodies, identifying and preventing infectious donations transfusion. All users of NAT should proceed to validation to investigate whether the procedures involved meet and ensure reliability in reducing the window period in units of transfused blood products to be feasible. The aim of this study was to report the results of the technical implementation of NAT in-house validated against international standards for the detection of HCV and HIV genomes in blood donors. The results were analyzed using Probit analysis software programs. For a 95% positivity, the detection limit was 98.50 IU/ml for HCV and 294. 84 IU/ml for HIV. The specificity was 100% and showed robust procedures. Validation of in-house PCR techniques can demonstrate that for sensitivity and specificity, are a valid and applicable in screening blood donors.

Capacidad fecundante espermática luego de la recuperación de espermatozoides mediante la técnica de Swim-up / Spermatic fertilization capacity after swin-up spermatozoa recovery technique

OBJETIVO: Evaluar en pacientes infértiles, la calidad espermática pre y post swim up y compararlacon una población de hombres fértiles.MÉTODOS: De 55 pacientes que asistieron al Servicio de Reproducción del Hospital Centenario de Rosario a los que se efectuó espermograma y estudios funcionales espermáticos según normas OMS (1999), se seleccionaron30 muestras de semen con volumen mayor de 1.0 ml, concentración de espermatozoides mayor de 5.000.000/ml y que no presentaban hiperviscosidad. Se compararon los resultados obtenidos de: movilidad progresiva (MP), morfología (M), condensación de la cromatina (CC) e integridad de la cromatina (IC), en el semen fresco sin tratar (G2) y luego del swim-up (G3), con los valores obtenidos en muestras de semen frescode 15 hombres fértiles (G1). Se utilizó microscopio óptico para estudiar la movilidad espermática progresiva,tinción Hematoxilina-Verde Brillante para analizar la morfología, azul de anilina para evaluar la condensaciónde la cromatina y el fluorocromo naranja de acridina para analizar la integridad de la cromatina. La técnica de recuperación espermática utilizada fue el swim-up, que se realizó en medio HTF, incubando en tubo Falcon a 45 ° en estufa de 37 °C gaseada (atmósfera de CO2 5%) durante 1 hora. Luego se tomaronde la capa superior los espermatozoides que sobrenadaron,en los que se efectuaron las prácticas post swim-up. Se aplicó la prueba t - Student a los valores de los parámetros MP, M, CC e IC en los 3 grupos de pacientes, observándose diferencia significativa para los cuatro parámetros al comparar G1 vs. G2 y G2 vs. G3 (p0.1), lo cual indica que los parámetros estudiados MP, M, CC e IC, en los espermatozoidesrecuperados del swim-up, son semejantes a la población de hombres fértiles.RESULTADOS: Estos resultados muestran que mediante swim-up se pueden recuperar gametas con capacidad fecundante potencial semejante a la población fértil, para aplicar en técnicas de reproducción asistida de baja complejidad, como la inseminación intrauterina, donde la selección natural es aún viable

OBJECTIVES: To investigate sperm quality before and after swim up in infertile patients, and to compare it with a fertile men population. METHODS: Semen samples from 55 patients consulting at the infertility services of the Hospitals “Centenario” in Rosario and “Eva Perón” in Gro Baigorria were collected and analyzed accordingly with the WHO guidelines. 30 sperm samples with a volume higher than 1.0 ml, and spermatozoid concentration higher than 5.000.000/ml, not presenting hyperviscosity were selected. Outcome variables including progressive mobility (PM), morphology (M), chromatin condensation (CC) and chromatin integrity (CI), were compared in fresh semen samples, between patients without previous treatment (G2) and after swim up (G3) and 15 fertile men (G1). Sperm morphology was evaluated by brilliant green hematoxyllin stain ;progressive mobility with a subjective method accordingly to WHO (1999); chromatin condensation with aniline blue test; and chromatin integrity with acridine orange as fluorocrom. Swim up technique was based on Berger et al. (1985) with mHTF, heatingthe samples in a Falcon tube in a 45º angle in a 37ºC gas heater for one hour (5% C02 atmosphere). Following incubation 0.5 ml of the overlay containing sperm cells that swam up from the pellet were removed to process the recovered spermatozoids. Student’s t test was applied to compare PM, M, CC, and CI between the four groups. A significant difference was found between G1 vs G3 and G2 vs G3 (p 0.1). It showed that PM, M, CC and CI parameters in the recovered spermatozoids after swim up were similar to fertile population. CONCLUSIONS: Our results indicate that through the swim up procedure gametes with fertile ability similar to normal fertile population can be recovered to be applied in low complexity in vitro fertilization techniques such as intrauterine insemination, where the natural selection is still viable

Estrés espermático modificado. Respuesta inmune y funcionalidad de la membrana del espermatozoide humano / Modified sperm stress test. Immune response and functionality of the human spermatozoid membrane

OBJETIVO: Nos propusimos estudiar, en muestras de semen de pacientes infértiles, la probable asociación del Test de Estrés Espermático Modificado (MOST) con la presencia de anticuerpos antiespermáticos (AAE), concentración de macrófagos y test Hiposmótico (THO). MÉTODOS: Se trabajó con 42 muestras de semen de pacientes infértiles a las que se efectuó espermograma según normas OMS. De ellas se seleccionaron 25 que no presentaron agrumación ni hiperviscosidad. Se aplicó el test MOST según la técnica original del autor. Los AAE se determinaron aplicando un test directo de aglutinación mixta TAC II, validado frente a Mar Screen (Fertility Technologies U.S.A. Los macrófagos se investigaron con tinción Rojo Neutro, y la funcionalidad de la membrana espermática con el test Hiposmótico, incu bando los espermatozoides en solución de 150 mOsm/ml compuesta por solución de Frutosa y Citrato de sodio. RESULTADOS: Se aplicó el test Chi cuadrado a los datos observacionales obteniendo los siguientes resultados: Existe asociación estadísticamente significativa entre la presencia de AAE y estrés espermático o MOST alterados (p<0.001). En todas las muestras que presentaban AAE, se obtuvieron valores del MOST anormal ( MOST<0.39).Se halló asociación estadísticamente significativa entre concentración aumentada de macrófagos y MOST anormal (p<0.01); también existe asociación entre THO alterados y MOST anormal (p<0.02). CONCLUSIÓN: El MOST como prueba de resistencia espermática a la lipoperoxidación forzada, reúne condiciones suficientes como para convertirse en un test predictor de fertilidad. Además el poder evaluar la resistencia espermática a las ROS y conocer sus efectos deletéreos sobre la función espermática, permite tomar medidas correctivas pertinentes (AU)

[Macrophages in human semen]. / Macrófagos en semen humano.

OBJECTIVES: To investigate the presence of macrophages in human semen samples and the function they carry out in the seminal fluid. Their presence was studied in relation to spermatic morphology, percentage of spermatozoids with native DNA, and presence of antispermatic antibodies. METHODS AND RESULTS: The work was performed with semen samples from 31 unfertile males from 63 couples in which the "female factor" was ruled out as the cause of infertility. Sperm study according to WHO (1992) was carried out in all samples, in addition to: DNA study with acridine orange as fluorocrom, macrophage concentration by neutral red in a Neubauer camera, and detection of antispermatic antibodies with a mixed agglutination test (TAC II) (validated with Mar Screen-Fertility technologies). Sperm morphology was evaluated by Papanicolaou test. 19/31 selected sperm samples (61.3%) showed increased concentration of macrophages, 13 of them (41.9%) with denaturalized DNA, and 8 (25.8%) abnormal morphology. Six samples showed increased macrophage concentration and predominance of native DNA, whereas 11 samples showed increased macrophages and abnormal morphology. Among 18 (58.1%) samples showing antispermatic antibodies 14 (77.7%) had an increased concentration of macrophages. Statistical analysis resulted in a high correlation between macrophage concentration and increased percentage of spermatozoids with denaturalized DNA (p < 0.05). An increased concentration of macrophages is associated with the presence of antispermatic antibodies (p < 0.05). There was not evidence of significant association between concentration of macrophages and percentage of morphologically normal spermatozoids (p < 0.05). CONCLUSIONS: We can conclude that macrophages are present in human semen and participate in immunovigilance contributing to improve the seminal quality.

Macrófagos en semen humano / Macrophages in human semen

OBJETIVO: Nuestro objetivo fue investigar la presencia de macrófagos en muestras de semen humano y la función que los mismos desempeñan en el fluido seminal. Para ello se los relacionó con morfología espermática, porcentaje de espermatozoides con ADN nativo y presencia de anticuerpos antiespermáticos (AAE). MÉTODO Y RESULTADOS: Se trabajó con muestras de semen de 31 hombres infértiles provenientes de 63 parejas en las que se descartó el "factor femenino" como causa de infertilidad. En todas ellas se efectuó espermograma según normas O.M.S., además de: estudio del ADN con Naranja de Acridina como fluorocromo; la concentración de macrófagos que se realizó con Rojo Neutro en cámara de Neubauer y la investigación de anticuerpos antiespermáticos con el test de aglutinación mixta TAC II (Validado frente a Mar Screen- Fertility Technologies). Para evaluar la morfología espermática se utilizó tinción Papanicolaou. De las 31 muestras de semen seleccionadas en 19 (61,3 por ciento) se observó concentración aumentada de macrófagos, de las cuales 13 (41,9 por ciento) presentaban ADN desnaturalizado y 8 (25,8 por ciento) morfología anormal. Seis de las muestras presentaron concentración de macrófagos aumentados y predominio de ADN nativo, mientras que once tenían macrófagos aumentados y morfología alterada . De las 18 (58,1 por ciento) muestras que presentaban AAE hubo 14 (77,7 por ciento) con concentración de macrófagos aumentada. De los estudios estadísticos realizados surge que, la concentración de macrófagos está altamente correlacionada con un aumento del porcentaje de espermatozoides con ADN desnaturalizado (p<0,05). La concentración aumentada de macrófagos está asociada a la presencia de AAE. (p<0,05). No se encontró asociación significativa entre la concentración de macrófagos y el porcentaje de espermatozoides morfológicamente normales (p<0,5). CONCLUSION: Podemos concluir que los macrófagos están presentes en el semen humano y participan en la inmunovigilancia contribuyendo a mejorar la calidad seminal (AU)

Inmunología y deterioro de parámetros seminales en varicocele / Immunology and deterioration of sperm parameters in varicocele

OBJETIVO: Investigar la presencia de autoanticuerpos antiespermatozoides (AAE) y su correlación con parámetros seminales en pacientes con varicocele. MÉTODOS: Se estudiaron 137 hombres jóvenes (15-35 años), con varicocele unilateral izquierdo sin cirugía previa, que consultaron en los Servicios de Reproducción y Urología de los Hospitales Eva Perón y Provincial del Centenario, ambos Hospitales Escuela de la Universidad Nacional de Rosario. Se efectuó espermograma según normas OMS, y se determinaron los AAE con TAC II. RESULTADOS: La motilidad estuvo alterada en un 67,2 por ciento (p< 0,001). La morfología resultó anormal en el 97,1 por ciento (p< 0,001). La concentración de espermatozoides estuvo disminuida en el 19,7 por ciento de los pacientes, pero no difiere significativamente de los valores hallados en la población normal. Los AAE se presentaron en el 46,7 por ciento. El estudio estadístico de asociación se realizó mediante un análisis de modelos log lineales. CONCLUSIÓN: Existe asociación entre las variables motilidad y recuento de espermatozoides. (p<0,01) (AU)

Correlación entre glicolipidos ABH en espermatozoides y test funcionales / Correlation between ABH glycolipids in sperm and functional tests

OBJETIVO: El objetivo de este trabajo fue evaluar si existe asociación entre los tests de integridad de membrana espermática y la expresión normal o alterada de los glicoesfingolipidos ABH de la misma. MÉTODO: Se trabajó con un grupo de 50 hombres que consultaron por infertilidad en los laboratorios de Reproducción del Hospital Escuela Eva Perón de Granadero Baigorria y del Hospital Provincial del Centenario de la ciudad de Rosario (Rep, Argentina.) Las muestras de semen fueron recogidas y analizadas según normas OMS, en las cuales se observó el porcentaje de espermatozoides muertos mediante el test de eosina (TE) y el porcentaje de espermatozoides hinchados con el test hiposmótico (TH), siendo además clasificadas según su expresión ABH esté disminuida o ausente (grupo 1) o normal (grupo 2), aplicando la técnica de inhibición de la hemaglutinación y consumo del anticuerpo específico. Para el análisis estadístico se realizó la comparación de los dos grupos considerados respecto de ambos tests de viabilidad espermática, utilizando la técnica no paramétrica de Mann- Whitney para muestras independientes, por no cumplirse los supuestos para la aplicación. RESULTADOS: Se evidencian diferencias signifcativas en la variable porcentaje de muertos (TE) para los dos grupos (p< 0,001), no evidenciándose diferencia significativa en la variable I porcentaje de hinchados (TH) para ambos grupos. CONCLUSIÓN: En base a nuestros resultados y a los datos bibliográficos, concluimos que existe asociación entre expresión ABH disminuida e integridad de la membrana del espermatozoide, principalmente a nivel de la cabeza. Lo que nos lleva a pensar que los glicoesfingolipidos ABH, se localizan preferentemente en esta zona del espermatozoide, involucrada en la interacción con el ovocito (AU)

Ventajas de un nuevo kit para la determinación de auto anticuerpos antiespermáticos / Advantages of a new kit for detection of sperm autoantibodies

OBJETIVO: Está ampliamente demostrado, que existe un vínculo importante entre la presencia de un nivel incrementado de anticuerpos antiespermatozoides (AAE) en hombres infértiles, comparado con hombres fértiles normales, sugiriendo ser ésta una posible causa de infertilidad. Se diseñó este estudio para correlacionar los métodos directos de aglutinación mixta TAC II (kit desarrollado y validado por nuestro equipo de trabajo ) con MAR-Screen (Fertility Technologies, Natick M.A, Bioscreen, Inc.) como métodos de screening. MÉTODOS: Se trabajó con 645 muestras de semen de pacientes que consultaron por infertilidad en los Servicios de Infertilidad y Urología de los Hospitales Provincial del Centenario y Eva Perón de Granadero Balgorria, ambos Hospitales Escuela de la Universidad Nacional de Rosario, Argentina y 30 controles fértiles. RESULTADOS: Los análisis estadísticos demostraron que TAC II tiene una sensibilidad del 87 por ciento y una especificidad del 100 por ciento. El valor predictivo positivo (VPP) hallado fue del 100 por ciento y el valor predictivo negativo (VPN) fue del 98 por ciento. CONCLUSIONES: Sugerimos el uso de TAC II, de similares características metodológicas a MAR- Screen, pero con ciertas ventajas, entre otras, la posibilidad de efectuar las pruebas con muestras congeladas y oligospérmicas, ya que no es necesario que los espermatozoides permanezcan móviles. Se garantiza una mayor especificidad inmunológica de la prueba al introducir el lavado de los espermatozoides (AU)

Células redondas en semen e infecciones genitales / Round cells in semen and genital infections

OBJETIVO: Sigue siendo controvertida la relación entre leucocitospermia e infecciones genitales. Asimismo resulta inexacto considerar el aumento de células redondas (CR) en semen como leucocitospermia. Nos propusimos determinar la posible asociación entre aumento de CR, leucocitospermia e infección bacteriana en pacientes infértiles. MÉTODO: Se analizaron 410 muestras de semen con las que se llevaron a cabo los estudio de movilidad, concentración, CR, morfología espermática, según criterios OMS. Se diferenciaron las células germinales inmaduras (CGI) por tinción con Papanicolau y los leucocitos polimorfonucleares (PMN) por el método de Nahoum-Cardozo. Para el examen directo se efectuaron estudios bacteriológicos en semen, primer chorro de orina y secreción uretral utilizando coloración de Gram Nicolle.Los cultivos se realizaron en medios enriquecidos Agar Columbia sangre, Agar chocolate y Agar Thayer Martin para gérmenes comunes. Para la identificación de Mycoplasma se sembró en medios líquidos y sólidos A7 Sheppard. La presencia de Chlamydia trachomatis se investigó por inmunofluorescencia directa en secreción uretral. RESULTADOS: El 79 por ciento de las muestras (324) resultado dispérmicas, el 9,02 por ciento (37) presentaron más de 10 CR/ campo. De estas últimas sólo el 29,7 por ciento (11) presentaban leucocitospermia. El coeficiente de correlación de Spearman con el que se midió la asociación entre concentración de CR/campo y leucocitos PMN/ml dio un valor de 0,2705 con una probabilidad asociada de 0,1046 que refleja la asociación no significativa entre las variables.En 32 muestras se realizaron estudios bacteriológicos de los cuales 13 resultaron positivos y sólo el 30,77 por ciento (4) se acompañaron con leucocitospermia. De las 19 muestras con bacteriología negativa el 15,78 por ciento (3) eran leucocitospérmicas. No hubo relación estadísticamente significativa ni entre CR aumentadas y presencia de gérmenes ( 2: 0,14965 p<0,05), ni entre PMN y gérmenes ( 2: 1,0139, p<0,05).CONCLUSIÓN: De lo expuesto surge la conveniencia de efectuar estudios bacteriológicos en el semen de pacientes infértiles independientemente de la presencia de CR en el examen directo (AU)