ABSTRACT
Introduction: Ticks are obligate hematophagous ectoparasitic arthropods of great relevance to public health, being vectors of various diseases. Ornithodoros brasiliensis (Acari: Argasidae) are endemic to the mountainous region of Rio Grande do Sul, Brazil. Their salivary composition contains bioactive molecules capable of modulating the immune system and affecting the host's hemostasis with local and systemic effects. Objectives: To characterize the anticoagulant activity of the salivary gland extract (SGE) of the tick Ornithodoros brasiliensis on blood coagulation. Methods: The EGSs were obtained by macerating the ticks' salivary glands, generating 2 different extracts (EGS-1 and EGS-2), after which the amount of protein was estimated by absorbance at 280 nm. SDS-PAGE 12.5% was used to analyze the protein profile of the samples and the biological test was carried out on the L1 and L2 larvae of the nematode Caenorhabditis elegans. EGS-1 was filtered on Amicon according to molecular weight (30, 10 and 3kDa) and the fractions obtained were subjected to RP-HPLC chromatography (C18). The chromatography samples and EGS-1 in different concentrations were tested in the rotational thromboelastometry equipment (Rotem®) (0.2 to 1.03 μg/well), as well as in the FXa and thrombin inhibition tests using chromogenic substrates (S2765 and S2238, respectively) (0.40 to 0.207 μg/test), following protocols pre- established by the laboratory and the equipment manual. EGS-2 was submitted in different concentrations (6.5 to 52 ng/well) to the rotational thromboelastometry test, and the global coagulation tests were carried out in duplicate, Prothrombin Time (PT) and Activated Thromboplastin Time (aPTT), using the commercial kits, with different concentrations of ESG-2 (6.5 to 97.5 ng/test) and finally FXa and thrombin inhibition tests using chromogenic substrates (S2765 and s2238, respectively) at a concentration of 6.5 ng/test. Results: EGS-1 showed in the protein dosage (1.118 μg/ml) and EGS-2 (6.5 μg/ml). In the activity test, the EGSs showed temporary and reversible paralysis. EGS-2 showed a prolongation of the clotting time with incoagulobility from 52 ng/well in the rotational thromboelastometry test. In TP, inhibition was 28.5% at 97.5 ng/well and in TTPa 48.6% at 78 ng/well. Thrombin inhibition averaged 13.7% and factor Xa inhibition averaged 30%. In relation to the chromatographic fractions, the P4 fraction showed a prolongation of the coagulation time in the rotational thromboelastometry test. The P3 fraction had a 25.4% inhibition of thrombin formation. The P4 fraction inhibited Factor Xa by 36.9%. Conclusion: The EGS of the O. brasiliensis tick has anticoagulant action, reaching incoagulability with 52ng/test in the rotational thromboelastometry assay and at least two proteins acting in the process. One of them is linked to thrombin, with the P3 fraction showing the greatest inhibition, and the other is linked to FXa inhibition, with the P4 fraction being more evident. The rotational thromboelastometry test showed an alteration, indicating an inhibitory action on the formation of fibrin networks.
Introdução: Os carrapatos são artrópodes ectoparasitas hematófagos obrigatórios, de grande relevância para a saúde pública, sendo vetores de diversas doenças. Os Ornithodoros brasiliensis (Acari: Argasidae) são endêmicos da região serrana do Rio Grande do Sul, Brasil. Na sua composição salivar possui a presença de moléculas bioativas capazes de modular o sistema imunológico e afetar a hemostasia do hospedeiro com efeitos locais e sistêmicos. Objetivos: Caracterizar a atividade anticoagulante do extrato da glândula salivar (EGS) do carrapato Ornithodoros brasiliensis sobre a coagulação sanguínea Métodos: Os EGS’s foram obtidos por maceração das glândulas salivares dos carrapatos, gerando 2 extratos distintos (EGS-1 e EGS-2), em seguida, a quantidade de proteínas foi estimada por absorbância a 280 nm. O SDS-PAGE 12,5% foi usado para analisar o perfil proteico das amostras e o teste biológico foi realizado nas larvas L1 e L2 do nematoide Caenorhabditis elegans. O EGS-1 foi submetido à filtração em Amicon de acordo com peso molecular (30, 10 e 3kDa) e as frações obtidas foram submetidas a cromatografia RP-HPLC (C18). As amostras da cromatografia e o EGS-1 em diferentes concentrações foram testados no equipamento de tromboelastometria rotacional (Rotem®) (0,2 a 1,03 μg/poço), como também nos testes de inibição do FXa e trombina utilizando substratos cromogênicos (S2765 e S2238, respectivamente) (0,40 a 0,207 μg/teste), seguindo protocolos pré-estabelecidos pelo laboratório e o manual dos equipamentos. O EGS-2 foi submetido em diferentes concentrações (6,5 a 52 ng/poço) ao teste de tromboelastometria rotacional, sendo realizados os testes globais de coagulação em duplicada, Tempo de Protrombina (TP) e Tempo de Tromboplastina Activada (TTPa), utilizando os kits comerciais, com diferentes concentrações de ESG-2 (6,5 a 97,5 ng/teste) e por fim submetidos testes de inibição do FXa e trombina utilizando substratos cromogênicos (S2765 e s2238, respectivamente) em uma concentração de 6,5 ng/teste. Resultados: O EGS- 1 apresentou na dosagem proteica (1,118 μg/ml) e o EGS-2 (6,5 μg/ml). No teste de atividade os EGS’s apresentaram uma paralisia temporária e reversível. O EGS-2 apresentou um prolongamento no tempo de coagulação com incoagulobilidade a partir de 52 ng/poço no teste de tromboelastometria rotacional. No TP a inibição foi de 28,5% com 97,5 ng/poço e em TTPa de 48,6% com 78 ng/poço. Na inibição de trombina, teve uma média de inibição de 13,7% e na inibição de fator Xa uma média de 30%. Em relação às frações cromatográficas, a fração P4 apresentou um prolongamento no tempo de coagulação no teste de tromboelastometria rotacional. A fração P3 obteve uma inibição de 25,4% na formação de trombina. A fração P4 obteve uma inibição de 36,9% na inibição de Fator Xa. Conclusão: O EGS do carrapato O. brasiliensis apresenta ação anticoagulante chegando a incoagulabilidade com 52ng/teste no ensaio de tromboelastometria rotacional e pelo menos duas proteínas atuantes no processo. Uma delas ligada a trombina com a representação da fração P3 com maior inibição e outra ligada a inibição do FXa sendo mais evidente com a fração P4. No teste de Tromboelastometria rotacional mostrou uma alteração, apontando uma ação inibitória na formação das redes de fibrina.
