An In Vitro Protocol to Study the Modulatory Effects of a Food or Biocompound on Human Gut Microbiome and Metabolome.

The gut microbiota plays a key role in gastrointestinal immune and metabolic functions and is influenced by dietary composition. An in vitro protocol simulating the physiological conditions of the digestive system helps to study the effects of foods/biocompounds on gut microbiome and metabolome. The Dynamic-Colonic Gastrointestinal Digester consists of five interconnected compartments, double jacket vessels that simulate the physiological conditions of the stomach, the small intestine and the three colonic sections, which are the ascending colon, transverse colon and descending colon. Human faeces are required to reproduce the conditions and culture medium of the human colon, allowing the growth of the intestinal microbiota. After a stabilization period of 12 days, a food/biocompound can be introduced to study its modulatory effects during the next 14 days (treatment period). At the end of the stabilization and treatment period, samples taken from the colon compartments are analysed. The 16S rRNA gene analysis reveals the microbiota composition. The untargeted metabolomics analysis gives more than 10,000 features (metabolites/compounds). The present protocol allows in vitro testing of the modulatory effects of foods or biocompounds on gut microbiota composition and metabolic activity.

El enriquecimiento de la dieta con polifenoles previene la disfunción endotelial coronaria mediante la activación de la vía de Akt/eNOS / Polyphenol-enriched diet prevents coronary endothelial dysfunction by activating the akt/enos pathway

Introducción y objetivos La dieta mediterránea rica en polifenoles se ha demostrado cardioprotectora, pero se desconocen los mecanismos implicados. Se ha investigado los efectos de un extracto de granada rico en polifenoles en la función coronaria de un modelo porcino. Métodos Los animales ingirieron durante 10 días una dieta normocolesterolémica o hipercolesterolémica. La mitad de los cerdos recibieron un suplemento de 625 mg/día de un extracto de granada (Pomanox®; 200 mg punicalaginas/día). Se analizó (flujo-Doppler) la vasodilatación tras la administración coronaria de acetilcolina, ionóforo de calcio, nitroprusiato de sodio y L-NG-monometilarginina (inhibidor de la enzima óxido nítrico sintasa endotelial) y la activación del eje Akt/óxido nítrico sintasa endotelial, la expresión de proteína quimiotáctica de monocitos–1 y el daño oxidativo coronario del ácido desoxirribonucleico y la oxidación de las lipoproteínas. Resultados Pomanox® redujo la disfunción endotelial inducida por la dieta hipercolesterolémica a valores de animales normocolesterolémicos tras la estimulación con acetilcolina y/o ionóforo de calcio. Este efecto se asoció con mayor actividad coronaria de Akt/óxido nítrico sintasa endotelial, menor expresión de proteína quimioatáctica de monocitos–1 y menor daño oxidativo. Las lipoproteínas de alta densidad mostraron mayor capacidad antioxidante y las lipoproteínas de baja densidad fueron más resistentes a la oxidación. Pomanox® no afectó a la vasorrelajación de los animales normocolesterolémicos. Todos los animales mostraron similar vasodilatación tras la administración de nitroprusiato de sodio y la L-NG-monometilarginina bloqueó la vasorrelajación de todos los agentes vasoactivos, a excepción del nitroprusiato de sodio. Conclusiones La toma de Pomanox® previene la disfunción endotelial coronaria inducida por la hiperlipemia, al preservar el eje Akt/óxido nítrico sintasa endotelial y contrarrestar la inflamación y el daño oxidativo vascular (AU)

Introduction and objectives: The Mediterranean diet, rich in polyphenols, has shown to be cardioprotective. However the mechanisms involved remain unknown. We investigated whether supplementation with a pomegranate extract rich in polyphenols renders beneficial effects on coronary function in a clinically relevant experimental model and characterized the underlying mechanisms. Methods: Pigs were fed a 10-day normocholesterolemic or hypercholesterolemic diet. Half of the animals were given a supplement of 625 mg/day of a pomegranate extract (PomanoxW; 200 mg punicalagins/day). Coronary responses to escalating doses of vasoactive drugs (acetylcholine, calciumionophore, and sodium nitroprusside) and L-NG-monomethylarginine (endothelial nitric oxide synthase inhibitor) were measured using flow Doppler. Akt/endothelial nitric oxide-synthase axis activation, monocyte chemoattractant protein-1 expression, oxidative deoxyribonucleic acid damage in the coronary artery, and lipoprotein resistance to oxidation were evaluated. Results: In dyslipidemic animals, PomanoxW supplementation prevented diet-induced impairment of endothelial relaxation, reaching vasodilatory values comparable to normocholesterolemic animals upon stimulation with acetylcholine and/or calcium ionophore. These beneficial effects were associated with vascular Akt/endothelial nitric oxide-synthase activation and lower monocyte chemoattractant protein-1 expression. PomanoxW supplementation reduced systemic oxidative stress (higher high-density (..) (AU)

Polyphenol-enriched diet prevents coronary endothelial dysfunction by activating the Akt/eNOS pathway.

INTRODUCTION AND OBJECTIVES: The Mediterranean diet, rich in polyphenols, has shown to be cardioprotective. However the mechanisms involved remain unknown. We investigated whether supplementation with a pomegranate extract rich in polyphenols renders beneficial effects on coronary function in a clinically relevant experimental model and characterized the underlying mechanisms. METHODS: Pigs were fed a 10-day normocholesterolemic or hypercholesterolemic diet. Half of the animals were given a supplement of 625 mg/day of a pomegranate extract (Pomanox; 200 mg punicalagins/day). Coronary responses to escalating doses of vasoactive drugs (acetylcholine, calcium ionophore, and sodium nitroprusside) and L-NG-monomethylarginine (endothelial nitric oxide-synthase inhibitor) were measured using flow Doppler. Akt/endothelial nitric oxide-synthase axis activation, monocyte chemoattractant protein-1 expression, oxidative deoxyribonucleic acid damage in the coronary artery, and lipoprotein resistance to oxidation were evaluated. RESULTS: In dyslipidemic animals, Pomanox supplementation prevented diet-induced impairment of endothelial relaxation, reaching vasodilatory values comparable to normocholesterolemic animals upon stimulation with acetylcholine and/or calcium ionophore. These beneficial effects were associated with vascular Akt/endothelial nitric oxide-synthase activation and lower monocyte chemoattractant protein-1 expression. Pomanox supplementation reduced systemic oxidative stress (higher high-density lipoprotein-antioxidant capacity and higher low-density lipoprotein resistance to oxidation) and coronary deoxyribonucleic acid damage. Normocholesterolemic animals elicited similar drug-related vasodilation regardless of Pomanox supplementation. All animals displayed a similar vasodilatory response to sodium nitroprusside and L-NG-monomethylarginine blunted all vasorelaxation responses except for sodium nitroprusside. CONCLUSIONS: Pomanox supplementation hinders hyperlipemia-induced coronary endothelial dysfunction by activating the Akt/endothelial nitric oxide-synthase pathway and favorably counteracting vascular inflammation and oxidative damage.

Chemical guide parameters for Punica granatum cv. 'Mollar' fruit juices processed at industrial scale.

To contribute for setting reference guideline for commercial juice from the pomegranate variety 'Mollar', chemical composition of eighteen samples directly obtained and commercialised in 2012 from three different fruit juice factories was investigated. According to the findings, the relative density of direct pomegranate juices varied between 1.061 and 1.064, which correspond to 15.15 and 15.71°Brix; titratable acidity changed between 2.6 and 2.8g/L, citric acid between 2.3 and 2.8 g/L, l-malic acid in a range of 1.3-1.4 g/L, and d-isocitric acid at levels less than 20mg/L. Glucose values ranged from 61.4 to 65.0 g/L, whereas fructose displayed values between 65.3 and 68.0 g/L. The predominant mineral was potassium (2,400-2,900 mg/L), followed by phosphorous, magnesium, calcium and sodium at levels of 81-89 mg/L, 17.6-28.5mg/L, 5.8-7.5mg/L and 4.3-5.3mg/L, respectively. Chemical determinations of anthocyanin and ellagitannin profiles and amino acids contents were also carry out. Concentrations of anthocyanins in commercialised samples were Cy3,5dG (19.30 ± 3.47 mg/L), followed by Dp3,5dG (17.87 ± 6.74 mg/L) and Cy3G (12.91 ± 6.32 mg/L). Punicalagin levels ranged between 503.70 and 762.85 mg/L, punicalins between 239.9 and 364.5mg/L, and free ellagic acid level was typically between 268.67 and 389.64 mg/L. The juice samples exhibited high amount of total phenolics (1,136-3,581 mg/L) as well as high ABTS radical scavenging activity (18-31 mmol Trolox/L).

Recombinant TNFα as oral vaccine adjuvant protects European sea bass against vibriosis: insights into the role of the CCL25/CCR9 axis.

Vibrio anguillarum is the main causative agent of vibriosis in cultured sea bass. Unfortunately, available vaccines against this disease do not achieve the desired protection. In this study, to accomplish uptake, processing, and presentation of luminal antigens, a commercial sea bass oral vaccine against V. anguillarum was improved with the addition of recombinant fish-self tumor necrosis factor α (rTNFα), as adjuvant. To explore mechanisms, systemic and local responses were analyzed through serum specific IgM titers, gene expression, lymphocytes spatial distribution in the gut, and in vitro functional assays. We found along the trial, over expressed transcripts of genes encoding cytokines and antimicrobial molecules at the gut of rTNFα supplied group. Orally immunized fish with vaccine alone confer protection against V. anguillarum challenge throughout a short time period. In contrast, adjuvant-treated group significantly extended the response. In both cases, achieved protection was independent of serum IgM. Yet, IgT transcripts were found to increase in the gut of rTNFα-treated fish. More importantly, fish treated with rTNFα showed a dramatic change of their T lymphocytes distribution and localization in gut mucosal tissue, suggesting specific antigen recognition and further intraepithelial T lymphocytes (IEL) activation. To determine the mechanism behind IEL infiltration, we characterized the constitutive and activated pattern of chemokines in sea bass hematopoietic tissues, identifying for the first time in fish gut, an intimate relation between the chemokine ligand/receptor CCL25/CCR9. Ex-vivo, chemotaxis analyses confirmed these findings. Together, our results demonstrate that improved oral vaccines targeting key cytokines may provide a means to selectively modulate fish immune defence.

Inmovilización de enzimas: micro-encapsulación de glutatión-S-transferasa / Immobilization of enzymes: micro-encapsulation of glutathione-S-transferase

En éste estudio se micro-encapsuló glutatión-S-transferasa (GST), enzima involucrada en la detoxificación de una amplia variedad de xenobióticos. Se determinaron las actividades enzimáticas de la enzima libre y de la microencapsulada. Se obtuvo GST de hígado de ratas, se purificó empleando SO (NH) y se trató con una solución de CaCI 0,2 M, carboxi-metilcelulosa 1 por ciento. Esta mezcla se agregó por goteo a una solución de alginato de sodio 0,75 por ciento, Tween 80 0,1 por ciento obteniéndose las microcápsulas. La actividad enzimática de GST fue determinada emplenado 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNB) como sustrato reaccionante con glutatión reducido (GSH). Una unidad de actividad enzimática (UE) de GST fue considerada como la cantidad de enzima capaz de producir 1 µmol de CDNB-GSH conjugado/min bajo las condiciones de ensayo. La actividad enzimática de enzima libre y en 1 g de esférulas fue de: 4,2 y 1,9 UE, respectivamente. La actividad específica en el extracto enzimático crudo fue de 3,2 UE/mg proteína, y de 12,02 en la enzima purificada, lo que indica que el grado de purificación de la enzima fue de 4 veces con relación al extracto crudo. Se determinó la actividad enzimática en las esférulas a los 7, 14 y 21 días posteriores a la microencapsulación y no se establecieron variaciones significativas. Se concluye que la estructura de la enzima se mantuvo estable y que el alginato de sodio demuestra ser un excelente soporte para microencapsular

Inmovilización de enzimas: micro-encapsulación de glutatión-S-transferasa / Immobilization of enzymes: micro-encapsulation of glutathione-S-transferase

En éste estudio se micro-encapsuló glutatión-S-transferasa (GST), enzima involucrada en la detoxificación de una amplia variedad de xenobióticos. Se determinaron las actividades enzimáticas de la enzima libre y de la microencapsulada. Se obtuvo GST de hígado de ratas, se purificó empleando SO (NH) y se trató con una solución de CaCI 0,2 M, carboxi-metilcelulosa 1 por ciento. Esta mezcla se agregó por goteo a una solución de alginato de sodio 0,75 por ciento, Tween 80 0,1 por ciento obteniéndose las microcápsulas. La actividad enzimática de GST fue determinada emplenado 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNB) como sustrato reaccionante con glutatión reducido (GSH). Una unidad de actividad enzimática (UE) de GST fue considerada como la cantidad de enzima capaz de producir 1 Amol de CDNB-GSH conjugado/min bajo las condiciones de ensayo. La actividad enzimática de enzima libre y en 1 g de esférulas fue de: 4,2 y 1,9 UE, respectivamente. La actividad específica en el extracto enzimático crudo fue de 3,2 UE/mg proteína, y de 12,02 en la enzima purificada, lo que indica que el grado de purificación de la enzima fue de 4 veces con relación al extracto crudo. Se determinó la actividad enzimática en las esférulas a los 7, 14 y 21 días posteriores a la microencapsulación y no se establecieron variaciones significativas. Se concluye que la estructura de la enzima se mantuvo estable y que el alginato de sodio demuestra ser un excelente soporte para microencapsular (AU)

A study on the kinetic mechanism of apoenzyme reconstitution from Aerococcus viridans lactate oxidase.

The preparation of a reconstitutable apoprotein is widely recognized as an important tool for studying the interactions between protein and coenzyme and also for characterizing the coenzyme-binding site of the protein. Here is described the kinetic analysis of the reconstitution of Aerococcus viridans lactate oxidase apoenzyme with FMN and FAD in the presence of substrate. The reconstitution was followed by measuring the increase in catalytic capacity with time. Lactate oxidase activity was easily removed by obtaining its apoenzyme in an acidic saturated ammonium sulphate solution. When the apoenzyme was reconstituted by the addition of FMN or FAD, a marked lag period was observed, after which the system reached a steady state (linear rate). To explain the binding mechanism of the cofactors to the apoenzyme, a kinetic model is proposed, in which the constants, k3 and k-3, representing the interaction of apoenzyme with cofactor are considered slow and responsible for the lag in the expression of activity. The affinity of apoenzyme was 51-fold higher for FMN than FAD.

Use of dye affinity chromatography for the purification of Aerococcus viridans lactate oxidase.

Lactate oxidase was purified from Aerococcus viridans (A. viridans) by dye affinity chromatography and FPLC ion exchange chromatography. The lactate oxidase could be purified by comparatively simple procedures, the purification achieved from a crude extract of A. viridans was 41-fold with a specific activity of 143 units/(mg of protein). The purified enzyme was a L-lactate oxidase, which catalyses the conversion of L-lactate in the presence of molecular oxygen to pyruvate and H(2)O(2). This purified lactate oxidase showed an apparent molecular mass of 48,200 in SDS-PAGE and the native molecular weight, as estimated by FPLC gel filtration, was 187,300. This molecular weight indicates that lactate oxidase exists in tetrameric form after gel filtration. To differing degrees, all the triazine dyes tested were inhibitors of lactate oxidase, solutions of free triazine dyes showing an inhibition mechanism which was both time- and pH-dependent.

Efecto oxidativo de la sobrecarga hepática de cobre / Oxidative effect of hepatic copper overload

A efectos de evaluar la citoxicidad de la excesiva producción de radicales libres en hígado, se estudió la lipoperoxidación en estructuras subcelulares y el estado de algunos componentes de los sistemas antioxidantes. Con tal fin se indujo la generación de radicales libres mediante la sobrecarga hepática de cobre y se determinaron los niveles de compuestos reactivos al ácido tiobarbitúrico en homogenatos y fracciones subcelulares de hepatocitos, la actividad de la enzima Cu-Zn superoxido dismutase (Cu-Zn-SOD) y la concentración de glutatión reducido (GSH). Ratas Wistar hembras, fueron dosificados con 0,2 por ciento de CuSO4 en el agua a fin de inducir la sobrecarga hepática de cobre. En suero se determinaron los niveles de cobre y la actividad de la fosfatasa ácida. En la semana doce de iniciado el ensayo, seis ratas dosificadas con CuSO4 fueron sacrificadas, junto con tres controles. Otras seis ratas del grupo dosificado fueron sacrificadas en la semana 16, momento de incremento de la actividad sérica de la fosfatase ácida, junto con tres ratas del grupo control. Se observó un alto contenido de cobre en los hígados provenientes de las ratas tratadas y evidencia de peroxidación de lfpidos en homogenatos y fracciones subcelulares. Esto fue vinculado con un incremento en la actividad de la Cu-Zn-SOD y con disminución de los niveles de GSH. Puede ser argumentado que los altos niveles de cobre inducirfan a un incremento en la actividad de la Cu-Zn-SOD y a una disminución de la concentración de GSH. Adicionalmente, en este trabajo ha sido evidenciado que la sobrecarga hepática de cobre promueve la peroxidación de lípidos.

Efecto oxidativo de la sobrecarga hepática de cobre / Oxidative effect of hepatic copper overload

A efectos de evaluar la citoxicidad de la excesiva producción de radicales libres en hígado, se estudió la lipoperoxidación en estructuras subcelulares y el estado de algunos componentes de los sistemas antioxidantes. Con tal fin se indujo la generación de radicales libres mediante la sobrecarga hepática de cobre y se determinaron los niveles de compuestos reactivos al ácido tiobarbitúrico en homogenatos y fracciones subcelulares de hepatocitos, la actividad de la enzima Cu-Zn superoxido dismutase (Cu-Zn-SOD) y la concentración de glutatión reducido (GSH). Ratas Wistar hembras, fueron dosificados con 0,2 por ciento de CuSO4 en el agua a fin de inducir la sobrecarga hepática de cobre. En suero se determinaron los niveles de cobre y la actividad de la fosfatasa ácida. En la semana doce de iniciado el ensayo, seis ratas dosificadas con CuSO4 fueron sacrificadas, junto con tres controles. Otras seis ratas del grupo dosificado fueron sacrificadas en la semana 16, momento de incremento de la actividad sérica de la fosfatase ácida, junto con tres ratas del grupo control. Se observó un alto contenido de cobre en los hígados provenientes de las ratas tratadas y evidencia de peroxidación de lfpidos en homogenatos y fracciones subcelulares. Esto fue vinculado con un incremento en la actividad de la Cu-Zn-SOD y con disminución de los niveles de GSH. Puede ser argumentado que los altos niveles de cobre inducirfan a un incremento en la actividad de la Cu-Zn-SOD y a una disminución de la concentración de GSH. Adicionalmente, en este trabajo ha sido evidenciado que la sobrecarga hepática de cobre promueve la peroxidación de lípidos. (AU)